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缺血性脑卒中是临床上常见的脑血管意外,已被世界卫生组织(WHO)认定为危害人类健康的“头号杀手”。目前仍无有效的防治措施!近年来大量的研究发现,各种不同的非缺血预处理方式均诱导出相同的缺血耐受效应,由此我们推测,这些不同的预处理方式极有可能作用于一些共同的信号通路从而诱导保护作用。目前已证实对胚胎发育具有重要作用的Notch信号通路在脑缺血损伤和修复中也扮演了一定的角色。高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)由于其安全可靠及可操作性强的优势,作为非缺血预处理的一个重要研究方向,其神经保护作用已得到临床证实。故本研究主要采用高压氧预处理的方式研究其对Notch信号通路的影响以及Notch信号通路在其脑保护中所起的作用。第一部分重复HBO预处理对Notch信号通路的影响研究方法1重复验证高压氧预处理的脑保护效应30只雄性SD大鼠随机分为三组:假手术组(sham),缺血再灌注组(I/R),高压氧预处理组(HBO+I/R)。高压氧预处理条件参照Xiong L等[3]方法。末次预处理后24h,行MCAO缺血2h,于再灌注24,48,72h进行神经行为学评分,于72h断头取脑测定脑梗死面积。2重复HBO预处理对Notch信号通路的影响研究2.1脑缺血再灌注后Notch信号通路的表达变化48只雄性SD大鼠随机分为两组:假手术组(sham,n=12),缺血再灌注组(I/R,n=36)。I/R组行MCAO缺血2h,再灌注后2,24,72h取缺血侧皮层及纹状体。利用免疫荧光,Western blotting技术检测各时相点Notch信号通路活性分子NICD的表达情况,同时利用RT-PCR技术测定其下游基因HES-1的表达情况。2.2高压氧预处理后Notch信号通路的表达变化雄性SD大鼠96只(280～320g)随机分为四组:假手术组(sham,n=12),缺血再灌注组(I/R,n=36),单纯高压氧组(HBO only,n=12),高压氧+缺血再灌注组(HBO+I/R,n=36)。末次高压氧预处理后24h,HBO only组取材;I/R组、HBO+I/R组一起建立MCAO模型缺血2h,再灌注后2,24,72h取缺血侧皮层及纹状体。利用免疫荧光,Western blotting技术检测各时相点Notch信号通路活性分子NICD的表达情况,同时利用RT-PCR技术测定其下游基因HES-1的表达情况。结果1高压氧预处理具有脑保护效应再灌注后24,48,72h神经功能学评分,HBO+I/R组明显优于I/R组(P<0.05);再灌注后72h,HBO+I/R组梗死面积明显降低(P<0.01vs. I/R组)。2重复HBO预处理对Notch信号通路的影响研究2.1 Western Blotting缺血侧纹状体:结果显示,sham组NICD表达较弱;I/R组再灌注后24h时NICD开始增高(*P<0.05 vs. sham),再灌注72h时表达最高($P<0.05 vs. I/R 24h)。高压氧预处理后缺血前(即HBO only组)NICD表达即有明显增加(#P<0.05 vs. sham)至缺血再灌注2h,24h时表达逐渐增高,而再灌注72h时表达降低;再灌注24h时表达最高(+P<0.05 vs. HBO+I/R 2h)。HBO+I/R组再灌注后2h NICD的表达高于I/R组同时间点,而再灌注后24h,72h则反之(#P<0.05 HBO+I/R vs. I/R)。缺血侧皮层:结果显示,sham组NICD表达较弱;I/R组再灌注后24h时NICD开始增高(*P<0.05 vs. sham),再灌注72h时表达最高($P<0.05 vs. I/R 24h)。HBO+I/R组再灌注2h时NICD表达明显增高(&P<0.05 vs. sham)持续增高至再灌注24h(+P<0.05 vs. HBO+I/R 2h),再灌注72h时表达降低。HBO+I/R组再灌注2h时NICD表达高于I/R组相同时间点(#P<0.05),而再灌注后72h则反之。从总的趋势可以看出,相对于I/R组,HBO+I/R组NICD的表达高峰前移。2.2 Real Time-PCR缺血侧纹状体:假手术组HES-1 mRNA水平较弱,I/R组再灌注后出现双峰现象,分别位于再灌注2h,72h(?P<0.05 vs. sham)时;再灌注72h时转录水平最高($P<0.05 vs. I/R 2h)。HES-1 mRNA的水平在高压氧预处理后缺血前(即HBO only组)即有明显增高(#P<0.05 vs. sham),再灌注后2h时达峰(+P<0.05 vs. HBO only & HBO+I/R 24,72h),随后逐渐降低;再灌注2h,24h时HBO+I/R组HES-1 mRNA水平高于I/R组(#P<0.05),而再灌注后72h时低于I/R组(#P<0.05)。缺血侧皮层HES-1 mRNA水平变化趋势同缺血侧纹状体。2.3免疫荧光免疫荧光双标记染色显示假手术组切片NICD样免疫反应阳性细胞较少,I/R组再灌注后24h NICD样阳性细胞明显增多,至72h呈持续增高趋势。而高压氧预处理组,缺血前NICD阳性细胞即有明显的增加,缺血再灌注后呈逐渐增加趋势,再灌注后24h(达高峰)NICD阳性细胞最多,而再灌注后72h时阳性细胞明显减少。结论1大鼠局灶性脑缺血后,Notch信号通路被激活;2 HBO预处理激活了Notch信号通路,并且使缺血再灌注后Notch信号相关分子NICD、HES-1表达高峰前移,提示其参与HBO预处理的脑保护效应。第二部分阻断Notch信号通路对重复HBO预处理脑保护作用影响研究方法1验证抑制剂的效果雄性SD大鼠12只(280～320g)随机分为三组(n=4):正常对照(sham)组;单纯高压氧(HBO only)组:行连续5d高压氧;DAPT+HBO组:高压氧预处理前3h给予50μm/L 5μL DAPT。各组动物于末次预处理后24h处死取材利用Western blotting方法检测纹状体NICD的水平。2阻断Notch信号通路对重复高压氧预处理脑保护作用影响雄性SD大鼠60只(280～320g)随机分为六组(n=10):假手术(sham)组,缺血再灌注(I/R)组,DAPT+缺血再灌注(DAPT+I/R)组,高压氧+缺血再灌注(HBO+I/R)组,溶剂对照预处理(Vehicle +HBO+I/R)组,DAPT+预处理(DAPT+HBO+I/R)组。DAPT于每次高压氧前3h经侧脑室给予,末次高压氧预处理后24h,建立MCAO模型缺血2h,再灌注24,48,72h各时相点分别对各组进行神经行为学评分,于再灌注72h断头取脑测定脑梗死面积。结果1验证抑制剂的效果与sham和HBO only组相比,DAPT+HBO组NICD的水平明显降低(#P<0.05),提示给药成功。2阻断Notch信号通路对重复高压氧预处理脑保护作用影响再灌注后24,48,72h神经功能学评分,HBO+I/R组明显优于DAPT+HBO+I/R组(#P<0.05);Vehicle+HBO+I/R组与HBO+I/R组没有统计学差异。再灌注后72h,DAPT+HBO+I/R组梗死面积明显增大(#P<0.05 vs. HBO+I/R组);Vehicle+HBO+I/R组与HBO+I/R组没有统计学差异。结论应用Notch信号通路抑制剂DAPT可以部分逆转HBO预处理的脑保护效应,进一步证实Notch信号通路参与了HBO预处理的脑保护效应。小结1.大鼠局灶性脑缺血后,Notch信号通路被激活;2.HBO预处理激活了Notch信号通路,并且使缺血再灌注后Notch信号通路相关分子NICD、HES-1表达高峰前移,提示其参与HBO预处理的脑保护效应;3.应用Notch信号通路抑制剂DAPT可以部分逆转HBO预处理的脑保护效应,进一步证实Notch信号通路参与了HBO预处理的脑保护效应。