论文部分内容阅读
背景:致瘤病毒卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)能够编码多种致瘤蛋白。其中,由K9基因编码的病毒干扰素调节因子1(viral interferon regulatory factor 1,vIRF1)可以在细胞核内阻止IRF3与CBP/P300结合,诱导IFN-α/β和IFN刺激基因的表达。此外,vIRF1可以诱导鼠成纤维细胞NIH3T3发生转化。本实验室前期的研究发现,过表达vIRF1能够促进人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖、迁移、侵袭和微管形成。同量异位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)技术检测显示,vIRF1可以改变多个宿主细胞蛋白的表达。其中,含CUB结构域蛋白(CUB-domain-containing protein 1,CDCP1)的表达变化明显。目的:研究CDCP1及相关微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)在KSHV vIRF1诱导内皮细胞迁移和侵袭中的作用。方法:在前期i TRAQ结果筛选出与细胞迁移、侵袭密切相关的候选蛋白CDCP1基础之上,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)和Western blot等实验对CDCP1表达进行验证。克隆靶向CDCP1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)于慢病毒质粒中,包装重组慢病毒。重组慢病毒感染稳定表达vIRF1的HUVEC细胞,构建敲低CDCP1的HUVEC细胞,并进行Transwell小室迁移和基质胶侵袭实验。同时,采用mi RNA芯片技术检测过表达vIRF1的HUVEC细胞中mi RNAs的表达谱,通过生物信息学软件预测,并配合虫荧光素酶报告实验和Western blot检测筛选靶向CDCP1 3’非翻译区(untranslated region,UTR)的mi RNAs。应用RT-q PCR、mi RNAs剂量依赖实验以及结合位点的点突变实验对候选mi RNA进行验证。最后,采用功能获得性实验证实候选mi RNA在vIRF1诱导内皮细胞迁移和侵袭中的作用。结果:RT-q PCR和Western blot实验证实CDCP1在过表达vIRF1的内皮细胞中明显上调。更为重要的是,CDCP1在卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)病人皮肤病损组织中表达明显高于正常皮肤组织。Transwell迁移和基质胶侵袭实验结果显示,敲低CDCP1显著地降低了vIRF1诱导的HUVEC的迁移和侵袭。mi RNA芯片技术、虫荧光素酶报告实验及Western blot检测表明,细胞mi R-218-5p能够直接作用于CDCP1 3’UTR区。功能学实验显示,靶向CDCP1的mi R-218-5p介导了vIRF1诱导的内皮细胞迁移和侵袭。结论:KSHV vIRF1通过抑制细胞mi R-218-5p并上调CDCP1的表达,从而促进内皮细胞的迁移和侵袭。