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研究背景及目的：输血相关急性肺损伤(TRALI)是一种罕见但可能致命的输血反应,是目前输血相关死亡的首要原因[1]。尽管TRALI的危害已经被人逐渐认识到,但对这种并发症的重视程度仍尚显不够[2]。目前TRALI的诊断根据临床症状主要是输血后6小时内发生急性呼吸窘迫的非心源性肺水肿[3]。TRALI的病理生理机制第一步涉及输血血液成分中含有献血者血浆中存在的白细胞的抗体,其中最常见的是人类白细胞抗体(HLA) I类和Ⅱ型抗体[4]。第二步机制涉及到中性粒细胞底物激活的肺生物活性因子造成直接肺血管内皮损害,毛细血管渗漏和急性肺损伤[5,6]。无论哪种机制,最后释放哪种因子最后都是直接作用于肺血管内皮从而引起输血相关急性肺损伤。邻苯二甲酸二乙基已酯(DEHP)及代谢产物邻苯二酸-单2乙基已酯(MEHP)是环境雌激素(EEs)中邻苯二甲酸酯类(PAEs)的一种,被大量应用于聚氯乙烯塑料制品中,是在环境中广泛存在,可以在人类羊水,脐带血,人类乳汁,精液,唾液检测到[7]。根据美国Swedish医疗中心2009年的一份研究报告显示：在使用血液袋,输液袋等含邻苯二甲酸酯的医疗器械时,血液袋内容物中脱落的DEHP及MEHP可以经静脉内给药而直接吸收。使用液相色谱/质谱(LCMS)技术检测献血中心有效期内第1天至第42天输血袋上清液中的DEHP和MEHP含量显示：DEHP的含量从第1天的34.3μM(20.0±SD)显著增加至第42天的433.2μM(131.2μSD); MEHP显著从第1天的3.7μM(2.8±D)增加至第42天的74.0μM (19.1±SD)。由此可见使用库血制品中含量超标的的DEHP和MEHP可能是输血相关急性肺损伤(TRALI)发生的一个重要因素。细胞凋亡作为细胞生物学在过去的10年研究最多的领域之一,是细胞程序性死亡的主要的研究形式,它在组织稳态发展过程中的核心作用[8-14]。其中细胞凋亡的众多信号通路中,Bcl-2家族蛋白是主要参与者。它们的主要功能是调节线粒体外膜(OMM)的通透性,释放不同的凋亡因子,即细胞色素C,Smac/DIABLO, Omi/HtrA2,核酸内切酶g,和AIF。Bax作为促凋亡蛋白与鉴定为抗凋亡蛋白的Bcl-2蛋白,同属Bcl-2家族[15,16]。N-乙酰基半胱氨酸(NAC)在谷胱甘肽形成的时候起着重要作用,它直接影响了萃取蛋白质的能力,被认为是一种强大的抗氧化剂,可以减轻细胞损伤作用[17]。为了探究MEHP (DEHP在人体内会转化生成MEHP)导致输血相关急性肺损伤(TRALI)发生的原因和机制,我们建立体外细胞染毒模型,探讨MEHP对血管内皮细胞HUVEC的直接毒效应及其机制。试验方法和结果：实验方法：1、将HUVEC细胞在含10%胎牛血清浓度的1640培养基培养条件下培养,培养状态稳定后,用不同浓度的MEHP (0、6.25、12.5、25、50、100μM)染毒一定时间。2、用MTT法、流式细胞术检测细胞的细胞活力和细胞凋亡率以检测MEHP对细胞的毒性作用。3、用DCFH-DA荧光探针、JC-1荧光探针等分别检测细胞胞内ROS的产生以及线粒体膜电位的变化。4、用试剂盒检测细胞胞内氧化应激指标包括胞内丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽(GSH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的情况。5、用酶标学的方法检测细胞凋亡可能存在的凋亡通路,检测caspase-3、caspase-8、 caspase-9三种酶的活力以验证内源性和外源性凋亡通路。6、用实时荧光定量PCR方法检测细胞裂解液中Bax, Bcl-2的含量。7、Western blot检测细胞裂解液中Bax, Bcl-2,细胞色素-c蛋白质的表达水平。8、利用用还原剂NAC预处理后,通过检测ROS的产生、细胞活力和凋亡率,看ROS是否介导了MEHP的毒效应。结果：1、细胞活力显著下降,细胞活力呈剂量和时间依赖性下降。2、细胞内ROS的生成,随着浓度的增加,中、高剂量组胞内ROS的含量明显增加。3、MEHP诱导HUVEC凋亡而导致胞内氧化应激指标紊乱。4、MEHP通过内源性和外源性途径共同诱导HUVEC凋亡。5、MEHP可以引起细胞内Bax和Bcl-2mRNA水平的改变。6、HUVEC细胞胞内蛋白质水平Bax与Bcl-2比值随着MEHP浓度增加而增加呈剂量依赖性,提示胞内促细胞凋亡的存在,而NAC孵育后可以减轻细胞凋亡。结论：MEHP诱导HUVEC细胞线粒体的损伤,引起氧化应激和脂质过氧化；并能通过ROS介导的内源性细胞凋亡通路诱导HUVEC细胞凋亡。MEHP可能诱导肺血管内皮细胞的凋亡进而导致输血相关急性肺损伤(TRALI)的发生。