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鲍姆纤孔菌(Inonotus baumii T.Wagner&M.Fisch.)是珍贵药用真菌桑黄的一种,具有十分重要的药用价值,是生物抗癌领域效果最好的真菌之一。倍半萜类化合物是桑黄的主要药用成分之一,具有重要的药理活性。本研究以鲍姆纤孔菌为研究对象,依据转录组数据,采用RACE技术克隆得到了倍半萜合酶基因PLS1全长,并对其全长序列进行了生物信息学分析;通过构建原核表达载体,成功诱导了目的蛋白表达,对鲍姆纤孔菌PLS1基因的功能进行了初步验证;利用qRT-PCR技术研究了不同培养时间和不同浓度的茉莉酸甲酯(MeJA)对鲍姆纤孔菌倍半萜合酶基因表达水平的影响。获得的主要研究成果如下:1、PLS1基因的克隆及生物信息学分析采用RACE技术克隆得到了鲍姆纤孔菌PLSl基因全长,测序结果表明该基因全长为1 448bp,包含一个1 008bp的完整开放阅读框,编码335个氨基酸。经生物信息学分析该基因编码蛋白的分子质量约为37.95KDa,理论等电点是4.79,蛋白总共包括5 281个原子,分子式为C1687H2618N4440512S20;该蛋白为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列,并对该蛋白的二级结构和三级结构进行了预测。2、PLS1基因的原核表达通过PCR将合适的酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ引入到PLS1基因的ORF两端,构建重组质粒pMD18-T-PLS1后,将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆,扩大培养阳性克隆菌液并提取重组质粒pMD18-T-PLS1,将其与表达载体pET-32a(+)用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,经T4 NDNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-32a-PLS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,筛选阳性克隆。在阳性克隆菌液中加入IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE分析,在相对分子量约37kDa附近有明显的蛋白质条带,其分子量与预测的蛋白分子量一致。3、培养时间及MeJA对倍半萜合酶基因表达水平的影响采用qRT-PCR技术研究了不同培养时间和不同浓度的MeJA对鲍姆纤孔菌倍半萜代谢途径中的5个倍半萜合酶基因表达水平的影响,发现倍半萜合酶基因的表达量随培养时间及MeJA浓度的变化而变化。随着培养时间的延长,倍半萜合酶基因的相对表达量逐渐增加,除第1d与对照组基本持平外,其他时间均高于对照,在第4d或第5d达到最大值;不同浓度 MeJA 诱导时,Unigene1790、Unigene5544、Unigene6151 和Unigene27582 4个倍半萜合酶基因的相对表达量均出现不同程度的增加,只有PLS1基因相对表达量降低。因此,从整体来看,倍半萜合酶基因在MeJA诱导时是上调表达的。