研究背景:高原病（high altitude disease,HAD）是由高原低压缺氧引起的一种高原特发性疾病,根据发病急缓分为急性高原病和慢性高原病两大类。近年来的研究显示,缺氧诱导的炎症反应参与高原病的发生发展,缺氧引起的炎性血管反应是急性高原病的重要机制,而缺氧诱导的炎性增生则是慢性高原病的重要机制。巨噬细胞是一种重要的固有免疫细胞,广泛存在于机体不同的器官组织中,执行多种不同的功能,包括对抗入侵的病原体和肿瘤细胞、协调伤口愈合、参与获得性免疫应答中的抗原提呈等。许多巨噬细胞参与的病理过程（如炎症、伤口愈合、动脉粥样硬化和肿瘤）也都以缺氧为特征。巨噬细胞对缺氧十分敏感,被激活的巨噬细胞可通过表达和分泌某些炎症细胞因子和趋化因子,活化和招募其它炎症细胞,从而参与缺氧引起的组织和机体损伤或重塑。研究显示,缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应与高原病的发生发展密切相关。因此,深入认识缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应及其调控机制,对于进一步阐明高原病的发病机制和研发防治药物具有重要意义。目前为止,缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应调控的具体机制仍不完全清楚。双特异性磷酸酶1（Dual specificity phosphatase 1,DUSP1）,也被称作丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶1（Mitogen-activated Protein Kinase Phosphatase-1,MKP-1）,是DUSP家族中最早被鉴定并且也是其中最重要的成员。DUSP1主要催化细胞内已激活的丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）家族成员（p38、JNK与ERK）中特异性基序TXY磷酸基团的水解,从而抑制它们的活性,进而阻断其下游相关生物学反应。Dusp1基因最初是作为在培养的小鼠细胞G0/G1转化过程中表达的一组基因之一而被鉴定的,后来的研究发现,多种应激因素如紫外线、病原体蛋白、缺氧等可以诱导DUSP1表达上调。本研究室前期对平原人急进5300m高原前后全血转录组学的研究结果显示,进入高原后DUSP1的转录水平表达较进入高原前明显升高。关于进入高原后DUSP1表达升高在高原病发生发展中的生物学意义尚并不清楚。鉴于DUSP1在负调控TLR配体诱导的巨噬细胞炎症反应中的重要作用及缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应在高原病发生发展中的重要作用,DUSP1可能通过调控缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应从而参与到高原病发生发展的调节中。目前关于缺氧引起DUSP1表达升高的机制以及DUSP1是否参与调控缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应尚不清楚。采用生物信息学分析的结果显示,活化转录因子3（Activating transcription factor 3,ATF3）可能是调节Dusp1表达的关键分子。因此,我们推测缺氧巨噬细胞可能通过转录因子ATF3上调DUSP1的表达,进而调节缺氧RAW264.7巨噬细胞中部分炎症相关细胞因子的表达,从而防止自身过度炎症免疫反应。本研究使用炎症反应研究中广泛使用的小鼠RAW264.7巨噬细胞建立缺氧巨噬细胞模型,初步探讨DUSP1在缺氧巨噬细胞中的表达机制及其在缺氧诱导的巨噬细胞炎症免疫反应调控中的作用,旨在为高原缺氧损伤的发病机制及防治提供新的思路及部分理论和实验依据。方法:以小鼠RAW264.7巨噬细胞作为研究模型。根据不同的实验目的,分为常氧（21%O₂）组、缺氧（1%O₂）组;缺氧+干扰序列对照组（si-C）、缺氧+siRNA组。缺氧组细胞置于缺氧工作站（1%O₂）中培养,常氧（21%O₂）组则置于普通培养箱中培养。采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测缺氧（1%O2）处理不同时间RAW264.7巨噬细胞中DUSP1和ATF3的mRNA和蛋白表达水平。采用qRT-PCR和酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测缺氧（1%O₂）处理不同时间RAW264.7巨噬细胞中炎症相关细胞因子IL-1β、IL-10和TNF-α的mRNA和分泌水平。采用RNA干扰技术干扰Dusp1表达,采用qRT-PCR、WB检测干扰效果;采用qRT-PCR和ELISA检测转染si-Dusp1后缺氧（1%O₂）处理24h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、IL-10和TNF-α的mRNA和分泌水平。采用RNA干扰技术干扰Atf3表达,采用qRT-PCR、WB检测干扰效果;采用qRT-PCR和WB检测转染si-Atf3后缺氧（1%O₂）处理24h RAW264.7巨噬细胞中DUSP1的mRNA和蛋白表达水平。采用qRT-PCR和ELISA检测转染si-Atf3后缺氧（1%O₂）处理24h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、IL-10和TNF-α的mRNA和分泌水平。采用WB检测p38的磷酸化水平变化。结果:1.缺氧对RAW264.7巨噬细胞中DUSP1表达的影响:qRT-PCR和WB的结果显示,与常氧组相比,缺氧处理12h、24h和36h RAW264.7巨噬细胞DUSP1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。2.DUSP1在缺氧RAW264.7巨噬细胞部分炎症细胞因子表达中的调节作用:与常氧组相比,低氧暴露12h Il1b、Il10 mRNA表达无明显变化（P>0.05）,低氧暴露24h和36h Il1b、Il10 mRNA表达均较常氧组显著升高（P<0.05）;与常氧组相比,低氧暴露12h Tnfa mRNA表达明显降低（P<0.05）,低氧24h和36h Tnfa mRNA表达与常氧组相比无明显变化（P>0.05）。与常氧组相比,缺氧处理12 h、24 h和36 h RAW264.7细胞IL-1β分泌水平均明显增加（P<0.05）。与常氧组相比,缺氧RAW264.7细胞中p38的磷酸化水平升高,其中缺氧24h组与常氧组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。与si-C组相比,干扰Dusp1基因表达后缺氧RAW264.7巨噬细胞中Il1b mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Tnfa mRNA表达水平明显降低（P<0.05）,而Il10 mRNA表达水平无显著改变（P>0.05）。干扰Dusp1表达后,缺氧RAW264.7细胞中IL-1β和IL-10分泌水平较si-C组明显增高（P<0.05）,而TNF-α分泌水平较si-C组明显降低（P<0.05）。与si-C组相比,转染si-Dusp1后缺氧RAW264.7细胞中p38的磷酸化水平明显升高（P<0.05）。3.ATF3在缺氧RAW264.7巨噬细胞中DUSP1及部分炎症相关细胞因子表达中的调节作用:qRT-PCR和WB的结果显示,与常氧组相比,缺氧处理12h、24h和36h RAW264.7巨噬细胞ATF3的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。qRT-PCR和WB的结果显示,与si-C组组相比,干扰Atf3基因表达后缺氧RAW264.7巨噬细胞中DUSP1mRNA和蛋白表达无明显改变（P>0.05）。干扰Atf3基因表达后,缺氧RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、IL-10和TNF-αmRNA和分泌水平均较si-C组明显升高（P<0.05）。与si-C组相比,转染si-Atf3后缺氧RAW264.7细胞中p38的磷酸化水平明显升高（P<0.05）。结论:1.缺氧能够诱导RAW264.7巨噬细胞中DUSP1的表达上调。2.缺氧能够诱导RAW264.7巨噬细胞中炎症相关细胞因子Il1b和Il10的mRNA表达上调,并且引起培养上清中IL-1β分泌水平增加。缺氧能够诱导RAW264.7巨噬细胞中p38磷酸化水平表达上调。DUSP1可能通过调节p38磷酸化调节IL-1β、IL-10和TNF-α的表达和/或分泌进而参与缺氧诱导的巨噬细胞炎症免疫反应调控。3.缺氧能够诱导RAW264.7巨噬细胞中转录因子ATF3的表达上调。转录因子ATF3可能并未参与缺氧诱导RAW264.7巨噬细胞DUSP1的表达上调的调控。ATF3可能通过调节p38磷酸化调节IL-1β、IL-10和TNF-α的表达和分泌进而参与缺氧诱导的巨噬细胞炎症免疫反应调控。