【摘 要】
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谷胺酰内肽酶（Glutamyl endopeptidases,GSE）能特异性水解谷氨酸和天冬氨酸α-羧基端所形成的肽键,它们属于丝氨酸蛋白酶并在结构上类似于胰凝乳蛋白酶。这类酶广泛存在于细菌中,而且某些GSE是病原菌的重要致病因子。由于GSE的高度底物特异性,它们作为工具酶在蛋白质结构分析、基于质谱测序的蛋白质组学研究、特异性切割融合蛋白等方面具有重要应用价值。同时,GSE还可以用于食品加工、肽
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谷胺酰内肽酶（Glutamyl endopeptidases,GSE）能特异性水解谷氨酸和天冬氨酸α-羧基端所形成的肽键,它们属于丝氨酸蛋白酶并在结构上类似于胰凝乳蛋白酶。这类酶广泛存在于细菌中,而且某些GSE是病原菌的重要致病因子。由于GSE的高度底物特异性,它们作为工具酶在蛋白质结构分析、基于质谱测序的蛋白质组学研究、特异性切割融合蛋白等方面具有重要应用价值。同时,GSE还可以用于食品加工、肽类物质合成等实际生产领域。但是,目前已知的GSE基本上都来源于嗜温细菌,热稳定性较差,这在很大程度上限制了这类酶的应用范围。进一步发掘和研究热稳定性好的GSE（例如来源于嗜热菌的GSE）不仅有助于我们进一步了解微生物的温度适应机制,也有利于拓展GSE的应用领域。在本研究中,我们完成了高温放线菌CDF（Thermoactinomyces sp.CDF）的基因组草图测序,发现该菌基因组至少编码58个蛋白酶,其中包含一个谷胺酰内肽酶（命名为TS-GSE）.基因序列分析表明,TS-GSE以前体形式合成,包括一个信号肽（30个氨基酸残基）、一个N端前肽（61个氨基酸残基）和一个成熟酶区（218个氨基酸残基）。我们将编码TS-GSE酶原（包括N端前肽和成熟酶区）的DNA片段克隆并转入大肠杆菌中表达。采用亲和层析纯化了TS-GSE成熟酶并对酶性质进行了表征。结果显示,在有CaCl2存在的条件下,TS-GSE的最适反应温度为850℃,在70℃保温6小时仍能保持90%的活性；在未补加CaCl2的条件下,该酶在70℃保温1小时仅残留20%的活性。这一结果说明Ca2+对TS-GSE的热稳定性具有重要作用。TS-GSE含有两对二硫键,分别为Cys32-Cys4和Cys180-Cys183。对这两对二硫键的突变分析结果显示,它们均具有维持TS-GS E分子结构稳定性的功能,其中Cys180-Cys183的作用更为显著。我们采用质谱技术分析了TS-GSE降解氧化型胰岛素B链的产物,发现降解位点仅发生在谷氨酸α-羧基端所形成的肽键,确定TS-GSE是具有高度底物特异性的谷胺酰内肽酶。这些结果显示,TS-GSE是到目前为止报道的热稳定性最高的GSE。我们进一步对TS-GSE的加工成熟分子机制进行了研究,发现TS-GSE酶原具有两个顺式加工位点,可以通过多条途径自我活化。TS-GSE酶原的N端前肽可以在成熟酶结构域上的活性中心的介导下,通过分子内的顺式加工在Glu-1-Ser1位点进行切割而去除,直接产生成熟酶；N端前肽还可以在Glu-12-Lys-11位点被顺式加工切除产生一个中间体,中间体N端残留的N端前肽部分（11个残基）被进一步切除而产生成熟酶。两个切割位点之间的肽段柔性较强,因此在酶原分子或中间体分子中这一肽段易受到较早活化的TS-GSE的攻击,通过分子间的反式加工作用被切除。另外,该肽段还可以被胰蛋白酶、蛋白酶K及CDF菌株所产生的主要胞外蛋白酶C2水解,说明TS-GSE也可以通过异源加工的方式成熟。通过对N端前肽进行截短和缺失突变分析,发现N端前肽对TS-GSE的正确折叠和成熟发挥重要作用。此外,N端前肽具有抑制TS-GSE活性的功能。我们以商品化的谷胺酰内肽酶V8为对照,分析了TS-GSE对蛋白质的降解能力。TS-GSE与V8蛋白酶降解β-casein所产生的降解产物类似,说明两者具有相同的底物特异性。不过TS-GSE对β-casein的降解效率高于V8蛋白酶。在37。C条件下,TS-GSE与V8蛋白酶对BSA和卵清蛋白这两种含有二硫键的球状蛋白的降解效果差,可能是由于这两种底物蛋白的潜在降解位点在此温度条件下内埋在分子内部而免受蛋白酶攻击。在70。C条件下,V8蛋白酶失活而不能发挥作用,而T S-GSE则能有效地降解BSA和卵清蛋白,很可能因为底物蛋白在高温条件下发生变性,多肽链伸展使降解位点暴露而受到TS-GSE的攻击。这些结果证明,TS-GSE是一种能在高温条件下有效水解蛋白质底物的嗜热谷胺酰内肽酶,具有很好的应用前景。
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