论文部分内容阅读
目的:探索组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase 9b,hdac9b)在斑马鱼肾小球发育中的表达,作用及其调控发育的分子机制。方法:(1)分离斑马鱼胚胎前肾小球,结合转录组测序(RNA-seq),绘制组蛋白去乙酰化酶家族成员在发育阶段的前肾中的表达情况;(2)利用全胚胎原位杂交技术(Whole-mount in situ hybridization,WISH)检测hdac9b在斑马鱼发育阶段的肾小球中的时序性和空间性表达及分布情况;(3)利用规律成簇的短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关核酸酶(CRISPR associated nuclease-9,Cas9)基因编辑技术,即CRISPR Cas9,构建hdac9b基因全身敲除斑马鱼品系,观察胚胎畸形率、考马斯亮蓝检测肾小球滤过屏障完整性、透射电镜观察肾小球超微结构、WISH检测足细胞(podocyte)关键标志分子podocin和nephrin表达变化情况以及肾脏祖细胞(renal progenitor cell,RPC)标志分子lhx1a、wt1b、mafba、pax2a的表达及分布变化情况;(4)构建斑马鱼Crispants,模拟hdac9b缺失的表型,随后用加帽Capped hdac9b mRNA注射单细胞,检测Capped hdac9b mRNA的回输能否拯救hdac9b Crispants的发育异常表型;(5)通过实时定量荧光PCR(real-time PCR,rt PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)的方法分别检测hdac9b Crispants胚胎中的β-Catenin及其下游靶基因表达情况,WB检测hdac9b缺失对细胞质和细胞核中β-catenin表达的影响,分别应用并比较Cappedβ-Catenin mRNA和NLS-β-Catenin mRNA的回输对hdac9b Crispants的发育异常表型的拯救情况。结果:(1)通过RNA-seq分析发现,组蛋白去乙酰化酶家族成员中,除了hdac2不在肾小球中表达,其余均有表达;其中hdac1表达最高,hdac9b次之;(2)WISH结果显示,hdac9b从24hpf开始于斑马鱼肾小球前体细胞中即开始表达,持续表达到受精后84小时(hours post fertilization,hpf)时表达消失;(3)与野生型胚胎相比较,hdac9b敲除引起严重的胚胎水肿和畸形、肾小球发育障碍、肾小球滤过屏障受损、足细胞足突广泛融合、足细胞关键标志分子podocin和nephrin的表达减弱,RPC标志分子lhx1a、wt1b、mafba、pax2a的表达和迁移受到抑制;(4)hdac9b Crispants可完全模拟(phenocopy)hdac9b基因敲除引起的表型,其后回输Capped hdac9b mRNA可改善受损的肾小球超微结构,足细胞与RPC标志分子的表达回升;(5)与相比对照组,hdac9b Crispants胚胎的β-Catenin及其下游靶基因myca和cyc D1的表达被显著抑制,其中Cytosolic-β-Catenin的表达上升,而Nuclear-β-Catenin的表达受到抑制,提示hdac9b的表达对于β-Catenin入核至关重要,Capped NLS-β-Catenin mRNA的回输,而不是Cappedβ-Catenin mRNA,可改善hdac9b Crispants胚胎的发育异常。结论:hdac9b通过促进β-Catenin的入核,参与肾脏祖细胞向正常足细胞的转化的过程,从而调控肾小球正常发育和功能。