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背景和目的颅内动脉瘤(intracranial aneurysms,IA)是颅内血管壁破坏导致的一类复杂性疾病,随着动脉瘤的发展,IA产生破裂,引起蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH),造成患者致残甚至死亡,带来严重的家庭和社会负担,IA的早期发现对防止其破裂具有重要意义。研究发现IA是一种受环境因素和遗传因素共同作用影响的复杂性疾病,已发现的危险因素有吸烟、高血压、年龄增长和性别等。但是遗传因素在IA的发生和发展过程中起着重要作用,蛛网膜下腔出血患者的一级和二级亲属发病率增加,与散发性动脉瘤相比,家族性动脉瘤倾向性更大,还有一些遗传病如常染色体显性遗传多囊肾病,I型神经纤维瘤病,遗传性出血性毛细血管扩张等与颅内动脉瘤形成有关。通过连锁分析和全基因组关联分析等方法,已发现有多个与IA相关的遗传位点,但是只有一部分得到了不同作者的验证,MMP-9基因是其中的一个。MMP-9基因位于人类20号染色体上,其翻译的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)属于明胶酶类的一种,可以降解弹性蛋白和变性的胶原和胶原片段。其表达和功能异常和多种疾病相关,但其表达和突变形式与疾病的发生机制还不清楚。本研究主要是通过对基因MMP-9的全外显子、部分调控区和外显子-内含子结合区进行测序,找出突变位点,分析突变对蛋白质的表达和功能的影响,推测MMP-9与颅内动脉瘤进展相关的分子机制,为IA的早期诊断,早期干预,防止产生蛛网膜下腔出血打下基础。研究对象从郑州大学第一附属医院神经介入科收集实验样本,研究对象为2018年3月—2019年12月入院确诊的48名颅内动脉瘤患者。方法1.采用由上海莱枫生物公司生产的2 ml血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA,并对提取DNA的浓度和纯度进行测定。2.在NCBI上查取MMP-9基因信息,获取MMP-9基因序列,找出要扩增的序列,使用Primer3在线引物设计,扩增范围包括全部外显子,外显子内含子结合部,部分5’UTR和3’UTR,然后在线Primer-BLAST进行特异性验证,最后交由公司合成引物。3.PCR扩增,PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳进行验证,然后切胶回收。4.上机测序,并用Chromas软件和Snap Gene软件对测序结果进行分析,查找双峰和突变。5.用SPSS 21.0软件对数据统计分析,比较患者和对照组差异是否具有医学统计学意义;用Mutation Taster软件分析基因突变位点的预测信息和突变效应分数,预测蛋白质功能是否引起改变。结果1.对48名患者的MMP-9基因的外显子及其部分内含子连接处进行双向测序,共检测出15个点突变,12个为已知突变,3个为新发现的突变。其中5个为同义突变,3个在内含子处突变,5个错义突变,2个3’UTR处突变。2.3个新发现的突变中一个为错义突变chr20:44640324(c DNA.954G>A,Arg312His),存在于1个个体中。另外两个为同义突变Chr20:44640217(c.847C>A,Leu276Leu),Chr20:44640367(c DNA.967C>T,Thr316Thr),分别存在于1个个体中。3.6号外显子chr20:44640225位点上,患病组与对照组的等位基因频率做Fisher确切概率法分析,P=0.0142<0.05,具有统计学意义,说明该突变位点与河南汉族人群颅内动脉瘤的发生和发展有关。该位点显性模型(GG+AG:AA)P=0.0354<0.05,具有统计学意义,说明该突变位点显性模型GG、AG与河南汉族人群颅内动脉瘤的进展相关。4.经Mutation Taster软件预测,5个错义突变中的4个错义突变可能会引起蛋白质的功能发生改变,chr20:44640225(c DNA.855A>G,Gln279Arg,突变效应分数0.98793)、chr20:44642406(c DNA.1740G>C,Arg574Pro,突变效应分数0.99999)、chr20:44643111(c DNA.2022 G>A,Arg668Gln,突变效应分数0.99999)、chr20:44640324(c DNA.954G>A,Arg312His,突变效应分数0.99999)。但是以上4个基因突变中,只有chr20:44640225位点的突变,等位基因频率和基因型频率具有统计学差异;chr20:44640324上的基因突变(c DNA.954G>A)为稀有变异,突变效应预测信息显示,这两个突变可能通过引起氨基酸改变进而蛋白质功能发生改变,引起颅内动脉瘤疾病。结论1.MMP-9基因的6号外显子上chr20:44640324(c DNA.954G>A,Arg312His)位点,可能是颅内动脉瘤致病的稀有变异,可能为致病突变。2.MMP-9基因的6号外显子上chr20:44640225(c DNA.855A>G,Gln279Arg)位点,与河南汉族人群颅内动脉瘤的发生和发展相关,G等位基因是风险基因。