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树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)作为功能最强的抗原提呈细胞，在恶性肿瘤的免疫治疗中起着重要的作用。DC作为抗肿瘤研究的难点在于大量获得DC十分困难。从不同来源、通过不同方法在体外诱导扩增DC的研究已有较多报道，但是体外诱导扩增DC的机制仍不清楚。如何稳定、高效地获得DC细胞的核心在于阐明DC细胞分化调控的机制。在诱导CD34＋细胞向DC分化过程中，有多种造血生长因子的参与，而细胞因子作用于细胞后，引起细胞内一系列变化均与细胞内信号传导系统及其传递机制密切相关。现有的研究提示，造血生长因子涉及的信号转导通路可能有许多条，其中JAK-STAT途径可能是造血生长因子信号转导的一条主要通路。CD34＋造血干/祖细胞诱导分化为DC的过程是否有JAK-STAT信号途径的参与，目前国内外尚未见报道。在本课题中，我们分离纯化CD34+细胞，在体外用GM-CSF+SCF+FL+IL-4 +TNFα诱导CD34+细胞向DC分化，并从细胞形态、表面标志和刺激同种异体T淋巴细胞增殖的功能三方面对DC进行鉴定。用免疫印迹方法检测细胞因子诱导前、分化第7天和第14天的细胞中与GM-CSF密切相关的JAK2和STAT5蛋白的表达及其在GM-CSF作用下蛋白酪氨酸磷酸化水平。本研究主要结果如下：1．先用淋巴细胞分离液和少量红细胞裂解液分离出人脐血单个核细胞，再用Vario-MACS系统阳性分离技术分离纯化CD34+细胞，从正常人脐血分离得到的CD34+细胞纯度为99.8%，且活细胞率>95%。2．经GM-CSF+SCF+FL+IL-4 +TNFα的共同诱导培养，可以促进脐血中CD34+造血干/祖细胞向DCs分化，经14天诱导分化最终可获得的细胞为初始干细胞量的70~85倍。<WP=8>3．我们对扩增得到的DCs从形态、表面标志和同种异型混合淋巴细胞反应三个方面加以鉴定，根据Sornasse D等提出的判别标准，本实验条件下诱导、分化扩增出的细胞是具有生物活性的DC。4．分离的CD34+细胞和诱导分化第7天、第14天的细胞在正常静止状态下，均表达一定量的JAK2，而且在所有的时间点JAK2蛋白的表达量类似。而GM-CSF刺激后JAK2的磷酸化水平则有显著差异，随着细胞向DC分化磷酸化JAK2水平显著增加。5．STAT5在CD34+细胞分化前即有明显表达，随着向DC分化，其表达量显著增加。GM-CSF刺激后，磷酸化的STAT5在d0时相对较低，随着细胞分化而显著增加。6．GM-CSF刺激培养14天的DC后，JAK2分子被迅速激活，而STAT5蛋白的活化高峰较JAK2的磷酸化滞后却更持久。结论：1. 采用Vario-MACS免疫磁珠阳性分离技术可以从人脐血分离得到高纯度的CD34+造血干/祖细胞，为进一步诱导分化获得高纯度DC提供了保证。2. 人脐血CD34+细胞在细胞因子GM-CSF+SCF+IL-4+FL+TNF-α作用下能生成大量具有典型形态、表型和功能的树突状细胞。3. 新鲜分离纯化的脐血CD34+细胞对GM-CSF的刺激存在低反应性。4. 在GM-CSF刺激作用下，随着CD34+造血干/祖细胞向DC分化，JAK2和STAT5蛋白的酪氨酸磷酸化水平增高，提示GM-CSF 可能通过JAK2-STAT5信号途径参与了CD34+细胞诱导向DC分化的调控机制