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研究背景肝细胞癌是全球范围内常见的癌症,死亡率高。在北美几乎每100000个人中有10个肝癌患者,在西欧、亚洲和非洲地区,甚至达到了每100000个人中有50到150个肝癌患者。肝脏是是富血管的肿瘤,易发生耐药。多药耐药的产生是阻碍化疗药物疗效的绊脚石。只有深入了解肝癌耐药的分子生物机制,找出耐药靶点,才能有效逆转耐药,从根本上改善肝癌的疗效。实验目的1.建立人肝癌索拉菲尼耐药细胞株模型,鉴定其耐药性,并研究耐药细胞的分子生物学特点。2.联合应用索拉菲尼和PI3k抑制剂LY294002后,检测耐药细胞的耐药性改变,探索耐药细胞耐药性和PI3k/Akt信号通路的关系。3.应用索拉菲尼PI3k抑制剂LY294002后,探索耐药细胞的转移和迁移能力的改变与PI3k/Akt信号通路的关系。实验方法1.索拉菲尼对HepG2、Huh7和MHCH97H等三株人肝癌细胞进行长期持续诱导;显微镜观察诱导过程细胞的形态学改变;CCK-8毒性实验进行药敏实验。基因芯片检测肝癌耐药细胞和亲本细胞的LncRNA和mRNA的表达差异。2.荧光定量PCR检测耐药相关基因ABCB1、ABCB1和ABCG2,间质标记基因Snail和Slug在耐药组和亲本组的表达差异;3.蛋白免疫印迹法检测上皮标记蛋白(E-cadherin),间质标记蛋白(Snail、Slug、N-cadherin、Vimenti)在耐药组和亲本组的表达差异,PI3k/Akt信号通路中的PI3k、P-Akt、Akt和PTEN,MAPK信号通路中的ERK信号通路中的P-Erk1/2和Erk1/2在耐药细胞和亲本细胞的差异;4.Transwell侵袭实验检测人肝癌耐药细胞的迁移、侵袭能力改变;5.蛋白免疫印迹法和Transwell侵袭实验检测肝癌耐药细胞加入LY294002后信号通路、耐药蛋白、EMT标记蛋白、迁移能力和侵袭能力的变化。6.建立裸鼠尾静脉转移模型,观察其肺和肝脏成瘤情况,研究亲本细胞和耐药细胞的转移能力的差别。实验结果1.索拉菲尼长期诱导人产生人肝癌细胞耐药性,诱导耐药相关基因和蛋白的产生,细胞毒性实验显示肝癌耐药细胞的药物敏感性低于亲本细胞。2.人肝癌细胞在长期索拉菲尼诱导下形态学发生上皮间质转化,同时人肝癌耐药细胞的上皮标记蛋白表达量降低,间质标记蛋白表达增加;体内外实验说明人肝癌耐药细胞比亲本细胞具有更强的迁移和侵袭能力。3.人肝癌索拉菲尼耐药细胞PI3k/Akt信号通路和Erk信号通路中的不同基因和蛋白表达量有不同比例增加,其中PI3k、P-Akt和P-Erk1/2明显增强,PTEN表达明显下降。4.用PI3k抑制剂LY294002后,肝癌索拉菲尼耐药细胞的药物敏感性明显增加。同时,肝癌耐药细胞的转移和侵袭能力明显下降。实验结论1.体外成功诱导人肝癌索拉菲尼耐药细胞株(HepG2R、Huh7R、MHCC-97H-R),肝癌细胞耐药性的产生可能与PI3k/Akt信号通路激活有关。2.人肝癌索拉菲尼耐药细胞发生上皮间质转化,增强了细胞的迁移和侵袭能力可能与PI3k/Akt信号通路的激活有关。3.长期索拉菲尼诱导后人肝癌细胞的LncRNA和mRNA表达差异明显。