论文部分内容阅读
目的：
课题组在前期咔唑类DNMT1小分子抑制剂基础上，设计合成了新的氟取代咔唑类DNMT小分子抑制剂。通过酶联免疫吸附法(ELISA)确定氟取代咔唑类化合物16-3对DNMT的抑制活性和选择性，并通过细胞、分子生物、及动物实验等方法初步探讨这一新型化合物体内外的抗肿瘤活性及其作用机制。
方法：
1.化合物结构的确定及DNMT选择性检测
通过质谱，红外，核磁等确定新型氟取代咔唑类化合物16-3的结构和纯度，并通过酶活性检测和Western blot实验检测化合物16-3对DNMT1的抑制活性和选择性。
2.化合物对各种肿瘤细胞增殖及周期的影响
用MTT检测法检测24h、48h、72h不同给药浓度下化合物16-3、DC517、RG108对肿瘤细胞A549、MNK45、HEPG2、HCT116增殖的影响。采用流式细胞术(Flow Cytomery，FCM)检测不同浓度16-3、DC517、RG108作用肿瘤细胞24h后对细胞周期的阻滞和凋亡率的影响。采用Western blot法，从凋亡、周期蛋白的角度，检测16-3、DC517、RG108作用于HCT116细胞后,Akt、P-Akt、GSK、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8等蛋白表达的情况。
3.化合物16-3对裸鼠HCT116细胞皮下移植瘤的影响
通过皮下注射将HCT116细胞种植于裸鼠左前腋下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。将造模成功的裸鼠随机分为模型组、RG108高中低剂量组、DC517高中低剂量组、和16-3高中低剂量组，每组6只，并设立空白对照组。经腹腔隔日给药，给药16天，观察裸鼠的生命体征变化，测量各组裸鼠的肿瘤体积生长变化。在末次给药24h后取材，测量裸鼠肿瘤大小，并称量裸鼠体重及肿瘤重量。采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin)染色法观察给药后裸鼠肝脏、肾脏、结肠及肿瘤组织的病理学变化特点;采用免疫组化检测肿瘤组织切片内DNMT1和P16蛋白的表达。
结果：
1.化合物16-3是课题组在先导化合物DC517基础上，设计合成的小分子非核苷类化合物，经检测其纯度在98％以上。DNMT酶活性检测发现这一化合物具有显著的DNA甲基化转移酶抑制活性，并具有DNMT酶属选择性。在蛋白表达方面对DNMT1蛋白量的表达没有显著影响。
2.化合物对不同肿瘤细胞和正常细胞增殖的影响
(1)16-3、DC517对不同肿瘤细胞增殖的影响：16-3、DC517对各肿瘤细胞的增殖均具有明显的抑制作用，其中对HCT116细胞的增殖抑制率最高，对HEPG2细胞的增殖抑制作用较弱。总体评价，化合物16-3的增殖抑制作用相对DC517要弱一些。另外，可以发现16-3、DC517对肿瘤细胞的抑制均有明显的时间浓度依赖性。
(2)16-3、DC517、RG108对正常细胞GES的抑制作用：RG108、DC517、16-3作用于GES细胞的IC50值分别为311.91±2.49μM，2.786±1.18μM，4.346±1.18μM。DC517和16-3对正常细胞的杀伤力要强于对肿瘤细胞的抑制作用。而化合物16-3毒性较先导化合物DC517有所降低。
(3)流式细胞术检测16-3、DC517、RG108对肿瘤细胞周期的阻滞作用：RG108主要阻滞细胞的S期，16-3和DC517主要使细胞周期停留在G2期。
(4)流式细胞术检测16-3、DC517、RG108对不同肿瘤细胞凋亡的影响：细胞凋亡与增殖抑制的结果基本一致，有一定的剂量依赖性。化合物对HCT116的促凋亡作用更加显著。其中化合物DC517和16-3凋亡率明显高于RG108。
3.化合物16-3影响HCT116细胞的作用机制
(1)16-3、DC517、RG108作用于HCT116细胞后周期蛋白的表达：三个化合物均对周期蛋白有调控作用。蛋白表达的周期差异性较细胞周期检测的差异性明显，这可能与细胞周期检测中存在的其它干扰因素相关。同时，具有抑癌作用的蛋白P53和P16的表达量有显著的提高。
(2)16-3、DC517、RG108作用于HCT116细胞后凋亡蛋白的表达情况显示，化合物对凋亡蛋白的表达具有调控作用。可以经PI3K/Akt的通路来阻滞细胞周期，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。
4.化合物16-3对裸鼠HCT116皮下移植瘤的影响
(1)动物生命体征：接种后，移植瘤成功率100％。裸鼠接种后至给药前：各组裸鼠饮食活动都正常;给药后，随着给药时间的累计，化合物DC517和16-3给药组小鼠体重下降，以DC517高浓度组最为明显，DC517和16-3高浓度组裸鼠肿瘤体积变化下降较为明显。
(2)16-3、DC-517、RG108的抑瘤率：通过对肿瘤体积和肿瘤重量的检测，发现化合物对裸鼠皮下移植瘤都有一定的抑制作用，其中DC517低剂量组和16-3中高剂量组对肿瘤的抑制更为显著。
(3)16-3、DC517、RG108对裸鼠病理组织的影响：通过病理切片HE染色可以看出化合物可以引起细胞溶解损伤，从而抑制肿瘤的生长。而肝脏、肾脏、结肠组织中细胞出现的损伤则表示化合物对组织细胞有一定的毒副作用。免疫组化的结果显示16-3给药组中P16蛋白的表达有显著提高，而DNMT1蛋白表达量没有显著变化。
结论：
化合物16-3是具有较高DNMT抑制活性和选择性的新型氟取代咔唑类化合物，体内外实验显示化合物16-3可以提高抑痛蛋白的表达量，阻滞肿瘤细胞停在G2周期，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖，达到抗肿瘤的作用。与前期的先导化合物DC517相比，其毒副作用有所降低。
课题组在前期咔唑类DNMT1小分子抑制剂基础上，设计合成了新的氟取代咔唑类DNMT小分子抑制剂。通过酶联免疫吸附法(ELISA)确定氟取代咔唑类化合物16-3对DNMT的抑制活性和选择性，并通过细胞、分子生物、及动物实验等方法初步探讨这一新型化合物体内外的抗肿瘤活性及其作用机制。
方法：
1.化合物结构的确定及DNMT选择性检测
通过质谱，红外，核磁等确定新型氟取代咔唑类化合物16-3的结构和纯度，并通过酶活性检测和Western blot实验检测化合物16-3对DNMT1的抑制活性和选择性。
2.化合物对各种肿瘤细胞增殖及周期的影响
用MTT检测法检测24h、48h、72h不同给药浓度下化合物16-3、DC517、RG108对肿瘤细胞A549、MNK45、HEPG2、HCT116增殖的影响。采用流式细胞术(Flow Cytomery，FCM)检测不同浓度16-3、DC517、RG108作用肿瘤细胞24h后对细胞周期的阻滞和凋亡率的影响。采用Western blot法，从凋亡、周期蛋白的角度，检测16-3、DC517、RG108作用于HCT116细胞后,Akt、P-Akt、GSK、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8等蛋白表达的情况。
3.化合物16-3对裸鼠HCT116细胞皮下移植瘤的影响
通过皮下注射将HCT116细胞种植于裸鼠左前腋下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。将造模成功的裸鼠随机分为模型组、RG108高中低剂量组、DC517高中低剂量组、和16-3高中低剂量组，每组6只，并设立空白对照组。经腹腔隔日给药，给药16天，观察裸鼠的生命体征变化，测量各组裸鼠的肿瘤体积生长变化。在末次给药24h后取材，测量裸鼠肿瘤大小，并称量裸鼠体重及肿瘤重量。采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin)染色法观察给药后裸鼠肝脏、肾脏、结肠及肿瘤组织的病理学变化特点;采用免疫组化检测肿瘤组织切片内DNMT1和P16蛋白的表达。
结果：
1.化合物16-3是课题组在先导化合物DC517基础上，设计合成的小分子非核苷类化合物，经检测其纯度在98％以上。DNMT酶活性检测发现这一化合物具有显著的DNA甲基化转移酶抑制活性，并具有DNMT酶属选择性。在蛋白表达方面对DNMT1蛋白量的表达没有显著影响。
2.化合物对不同肿瘤细胞和正常细胞增殖的影响
(1)16-3、DC517对不同肿瘤细胞增殖的影响：16-3、DC517对各肿瘤细胞的增殖均具有明显的抑制作用，其中对HCT116细胞的增殖抑制率最高，对HEPG2细胞的增殖抑制作用较弱。总体评价，化合物16-3的增殖抑制作用相对DC517要弱一些。另外，可以发现16-3、DC517对肿瘤细胞的抑制均有明显的时间浓度依赖性。
(2)16-3、DC517、RG108对正常细胞GES的抑制作用：RG108、DC517、16-3作用于GES细胞的IC50值分别为311.91±2.49μM，2.786±1.18μM，4.346±1.18μM。DC517和16-3对正常细胞的杀伤力要强于对肿瘤细胞的抑制作用。而化合物16-3毒性较先导化合物DC517有所降低。
(3)流式细胞术检测16-3、DC517、RG108对肿瘤细胞周期的阻滞作用：RG108主要阻滞细胞的S期，16-3和DC517主要使细胞周期停留在G2期。
(4)流式细胞术检测16-3、DC517、RG108对不同肿瘤细胞凋亡的影响：细胞凋亡与增殖抑制的结果基本一致，有一定的剂量依赖性。化合物对HCT116的促凋亡作用更加显著。其中化合物DC517和16-3凋亡率明显高于RG108。
3.化合物16-3影响HCT116细胞的作用机制
(1)16-3、DC517、RG108作用于HCT116细胞后周期蛋白的表达：三个化合物均对周期蛋白有调控作用。蛋白表达的周期差异性较细胞周期检测的差异性明显，这可能与细胞周期检测中存在的其它干扰因素相关。同时，具有抑癌作用的蛋白P53和P16的表达量有显著的提高。
(2)16-3、DC517、RG108作用于HCT116细胞后凋亡蛋白的表达情况显示，化合物对凋亡蛋白的表达具有调控作用。可以经PI3K/Akt的通路来阻滞细胞周期，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。
4.化合物16-3对裸鼠HCT116皮下移植瘤的影响
(1)动物生命体征：接种后，移植瘤成功率100％。裸鼠接种后至给药前：各组裸鼠饮食活动都正常;给药后，随着给药时间的累计，化合物DC517和16-3给药组小鼠体重下降，以DC517高浓度组最为明显，DC517和16-3高浓度组裸鼠肿瘤体积变化下降较为明显。
(2)16-3、DC-517、RG108的抑瘤率：通过对肿瘤体积和肿瘤重量的检测，发现化合物对裸鼠皮下移植瘤都有一定的抑制作用，其中DC517低剂量组和16-3中高剂量组对肿瘤的抑制更为显著。
(3)16-3、DC517、RG108对裸鼠病理组织的影响：通过病理切片HE染色可以看出化合物可以引起细胞溶解损伤，从而抑制肿瘤的生长。而肝脏、肾脏、结肠组织中细胞出现的损伤则表示化合物对组织细胞有一定的毒副作用。免疫组化的结果显示16-3给药组中P16蛋白的表达有显著提高，而DNMT1蛋白表达量没有显著变化。
结论：
化合物16-3是具有较高DNMT抑制活性和选择性的新型氟取代咔唑类化合物，体内外实验显示化合物16-3可以提高抑痛蛋白的表达量，阻滞肿瘤细胞停在G2周期，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖，达到抗肿瘤的作用。与前期的先导化合物DC517相比，其毒副作用有所降低。