【摘 要】
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背景:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是神经外科重症疾病,具有高死亡率、高致残率的特点。动脉瘤破裂导致的SAH占到所有SAH患者的85%左右。近年来大量临床和动物研究表明,早期脑损伤(Early brain injury,EBI)是导致临床上SAH患者不良预后的主要原因,细胞凋亡、炎性反应、氧自由基损害、脑缺血、血脑屏障破坏以及钙超载等因素都参与了EBI的发
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(81971122); 江苏省自然科学基金青年项目(BK20180126);
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背景:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是神经外科重症疾病,具有高死亡率、高致残率的特点。动脉瘤破裂导致的SAH占到所有SAH患者的85%左右。近年来大量临床和动物研究表明,早期脑损伤(Early brain injury,EBI)是导致临床上SAH患者不良预后的主要原因,细胞凋亡、炎性反应、氧自由基损害、脑缺血、血脑屏障破坏以及钙超载等因素都参与了EBI的发生与发展,其中神经元凋亡在EBI中扮演重要角色。虽然部分实验表明,抑制单一的凋亡信号通路如MAPKs、NF-κB等可以抑制SAH后EBI期的神经元凋亡,改善实验动物SAH的预后,但是这些研究结果并没有转化到临床。近年来,寻找可以同时调控多条神经元凋亡信号通路的靶点成为当前的研究热点。肿瘤坏死因子受体相关因子3(Tumour necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)可以通过与受体、酶和调节因子结合,调控细胞凋亡、炎症和氧化应激等多条信号通路。在神经系统疾病中,包括缺血性脑卒中、脊髓外伤等,都发现TRAF3可以通过与TAK1相互作用同时调控MAPKs和NF-κB两条信号通路调控神经元凋亡。我们前期实验发现TAK1参与SAH后神经元凋亡的调控,因此我们猜测TRAF3可以在SAH后的EBI期通过与TAK1相互作用,调控MAPKs和NF-κB信号通路调控神经元凋亡。在此课题中我们建立了小鼠和体外原代神经元的SAH模型,深入探讨TRAF3蛋白在SAH后EBI期神经元凋亡中的作用及其潜在的调控机制,探讨TRAF3成为临床改善SAH不良预后的新的治疗靶点的临床转化能力。方法:我们使用成年雄性C57B/6J小鼠,通过颈内动脉刺破建立小鼠SAH模型,在体外培养的原代神经元中,通过在培基中加入氧合血红蛋白模拟体外神经元SAH模型。使用Western Blot检测小鼠和体外培养神经元SAH后不同时间点TRAF3蛋白的表达变化,采用免疫荧光双染技术检测TRAF3在SAH小鼠颞叶皮层中的细胞定位。随后,我们通过侧脑室注射TRAF3 si RNA和在培基中加入TRAF3 si RNA下调SAH小鼠和体外神经元TRAF3蛋白的表达,使用Western Blot、TUNEL染色、尼氏染色等多种方法评估TRAF3蛋白对小鼠SAH后神经元功能的影响,使用Western Blot、LDH等方法评估TRAF3蛋白对体外神经元SAH后神经元凋亡的影响。此外我们还通过免疫共沉淀、267-376氨基酸结构域突变的TRAF3腺病毒进一步探讨TRAF3调控SAH后神经元凋亡的潜在机制。结果:实验结果提示:1)TRAF3蛋白在SAH后表达增加,24小时达到表达高峰后逐渐下降,且在小鼠颞叶皮层中,TRAF3主要定位于神经元,部分在小胶质细胞中表达。2)我们采用TRAF3 si RNA下调TRAF3的蛋白表达后,SAH小鼠和SAH体外原代神经元的神经元凋亡明显改善。3)同时我们发现,下调TRAF3的蛋白表达后,小鼠和原代神经元SAH后的TAK1磷酸化激活减少,TAK1调控的MAPKs和NF-κB神经元凋亡相关信号通路被抑制。4)免疫共沉淀结果显示SAH后TRAF3蛋白与TAK1蛋白存在直接相互作用。5)用TRAF3腺病毒上调TRAF3蛋白的表达可以使TAK1的磷酸化和调控的MAPKs和NF-κB被激活,而用267-376氨基酸结构域突变的TRAF3腺病毒上调则不能。由此我们证实SAH后TRAF3蛋白通过与TAK1直接作用,激活TAK1磷酸化和下游MAPKs和NF-κB信号通路调控神经元凋亡。结论:SAH后TRAF3通过与TAK1结合,激活TAK1磷酸化,通过下游MAPKs和NF-κB信号通路调控神经元凋亡,下调TRAF3蛋白的表达可以通过抑制上述信号通路改善SAH后EBI期的神经元凋亡,从而改善小鼠SAH后的神经功能障碍。本实验有助于我们研究SAH后神经元凋亡的潜在调控机制,为TRAF3蛋白成为临床改善SAH不良预后的新的治疗靶点提供了更为有力的证据。
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