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背景:胰腺癌的发病率近年有升高趋势。因其恶性程度极高,且目前临床的诊治手段效果均欠佳,发展诊治该肿瘤的新方法显得较为迫切。随着分子生物学理论和技术的发展,在该领域内探讨该肿瘤的发病机理和探索新的诊疗手段成为近期热点。本文探讨MicroRNA(miRNA)在胰腺癌中的异常表达和在该肿瘤发病机制中的作用。目的:1.比较胰腺癌病人的肿瘤组织和正常胰腺组织的miRNA表达谱。并初步筛选出在胰腺癌组织中表达明显异常的miRNA分子。2.了解部分在胰腺癌中异常表达的miRNA对胰腺癌细胞生长和凋亡的影响。3.选择对胰腺癌细胞生长或凋亡有明显影响的miRNA分子,了解其在胰腺癌发病的信号途径中所起的作用。4.通过本研究,希望为胰腺癌的治疗提供新的分子靶点,为胰腺癌相关的诊断、预后标志物研究提供新的内容。方法:1.利用miRNA芯片技术比较胰腺癌组织,胰腺癌细胞株ASPC-1和正常胰腺组织的miRNA表达差异。2.根据表达谱结果,选择部分差异表达的miRNA(miR-21,24,191,221),利用脂质体转染反义核苷酸的实验技术,单独和联合下调miRNA的活性。利用荧光显微镜和荧光定量PCR技术检测该方法的有效性。利用MTT法分析转染前后细胞活力的变化;caspase3检测和流式细胞仪FITC-Annexin V/PI法分析转染前后细胞凋亡的变化。流式细胞PI法分析转染前后细胞生长周期的变化。3.根据下调miRNA后对肿瘤细胞生长和凋亡的影响,选择其中影响最明显的miR-21。利用生物信息学查找其可能与胰腺癌发病相关的靶基因,并选择其中的PTEN基因,利用荧光定量PCR技术和Western blot技术,分别检测下调miR-21后PTEN mRNA和PTEN蛋白表达的变化。结果:1、利用miRNA芯片技术,在胰腺癌组织和细胞株中,共检测了416个人类miRNAs分子。发现其中有40个miRNAs分子升高,127个miRNAs降低。2、本实验利用脂质体转染反义核苷酸的实验技术,其下调miRNA的有效性得到证实。下调不同的miRNA对细胞生长各指标有不同影响。综合评价转染前后细胞生长的各项指标,发现其中有明显影响的组为:单独下调mir-21增加细胞凋亡,降低细胞活性;单独下调mir-221改变细胞周期,减少增殖期细胞,增加G0G1期细胞。但对细胞活性影响无明显影响;mir-221和mir—21共同下调时,细胞活力较mir-21单独转染进一步下降。其它转染各组对以上各项细胞生长指标影响则不明显。3、下调mir-21后,PTEN mRNA变化不明显,但PTEN蛋白表达明显升高。全文结论:1、胰腺癌组织和细胞株中,均存在大量异常表达的miRNAs分子。2、仅部分在胰腺癌中异常表达的miRNA对胰腺癌细胞的生长和凋亡有直接影响,选用一定组合的联合转染,miRNA对细胞生长和凋亡的影响可比在单独转染时加强。3、miR-21可在转录后翻译水平阻止其靶基因PTEN蛋白的表达,从而对胰腺癌发病的信号途径产生影响。