【摘 要】
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背景:肾素血管紧张素系统（RAS）主要由血管紧张素转换酶/血管紧张素Ⅱ/血管紧张素Ⅱ-1型受体轴（ACE/Ang Ⅱ/AT1R）和血管紧张素转换2/血管紧张1-7/MasR轴（ACE 2/Angl-7/MasR）组成并受其调控,后者通过拮抗前者的心脏负性作用以保持心脏稳态平衡。心肌梗死（MI）后,缺血区域AT1R上调介导了 RAS异常激活引起的心室不良重构。替米沙坦（Tel）、Ang1-7分别为作
【基金项目】
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国家自然科学基金（81971765）；
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背景:肾素血管紧张素系统（RAS）主要由血管紧张素转换酶/血管紧张素Ⅱ/血管紧张素Ⅱ-1型受体轴（ACE/Ang Ⅱ/AT1R）和血管紧张素转换2/血管紧张1-7/MasR轴（ACE 2/Angl-7/MasR）组成并受其调控,后者通过拮抗前者的心脏负性作用以保持心脏稳态平衡。心肌梗死（MI）后,缺血区域AT1R上调介导了 RAS异常激活引起的心室不良重构。替米沙坦（Tel）、Ang1-7分别为作用于两轴的药物,均可抑制RAS的激活从而保护心梗后心功能。自组装多肽是一种良好的药物载体,具有广泛生物适用性,因其结构可变、功能多样、易获取、成本低的特点,具有良好的应用前景。因此,我们构建了一种双药纳米组装体（Dual-drugs nano-assemblies,DDNA）,它由自组装血管紧张素 1-7 多肽（Self-assembling Angiotensin1-7,SAA1-7）与Tel共组装而成,利用Tel对AT1R的高亲和力,实现DDNA对心肌梗死的靶向治疗。目的:构建SAA1-7与Tel共组装的双药纳米组装体（Dual-drugs nano-assemblies,DDNA）,并探讨它对小鼠心肌梗死的治疗作用及相关机制。方法与结果:1.制备SAA1-7,检测其组装性能及抗酶解能力,通过分子对接筛选出适合共组装的ARB药物。两者通过共组装获得DDNA后,测定以下参数:组装体微观结构,临界胶束浓度,流变参数,荧光发射光谱,药物装载率,药物释放,与MasR相互作用力。结果表明SAA1-7较天然Ang1-7抗酶解能力更强;SAA1-7与Tel共组装后,Tel可掺杂至SAA1-7的纤维中,形成新的纳米纤维结构;临界胶束浓度、流变参数、荧光发射光谱均提示DDNA中分子π-π堆积及疏水作用增强,两者结合更稳定。DDNA具有良好的载药率及稳定的药物率;并且改装后的DDNA仍可与MasR良好地结合。2.建立小鼠心梗模型,尾静脉注射荧光标记的DDNA,检测其药物的体内分布;实验分组:假手术组（Sham）,造模组（MI）,DDNA,物理混合药（T+A）,Tel,Ang1-7,空载组（Vehicle）,干预4周后比较各组以下参数:心脏超声,马松染色,α-SMA免疫荧光,TGF-β1、Caspase3免疫组化染色,血清IL-6,TNF-α,血清肌酐（CR）,血清谷丙转氨酶（ALT）。结果表明DDNA可靶向心梗部位,抑制心肌细胞凋亡、降低炎症水平、减少心梗面积、抑制不良心室重构,且效果优于物理混合双药及单药治疗组,具有良好的生物相容性。3.体外建立糖氧剥脱（oxygen-glucose deprivation,OGD）的心肌细胞模型;荧光显微镜观察DDNA与AT1R共定位;流式细胞学检测药物摄取;Tunel染色检测细胞凋亡水平;Western blot检测凋亡相关蛋白、NFκB的表达;荧光探针检测活性氧（ROS）表达;RT-qPCR检测炎症因子表达;使用缺氧心肌细胞来源的条件培养基（CM）及Ang Ⅱ构建纤维化模型,检测成纤维细胞α-SMA免疫荧光表达;划痕实验检测成纤维细胞迁移能力。结果提示,DDNA具有AT1R介导的心肌细胞靶向作用;可通过促进AKT磷酸化,抑制Bax/Bcl-2、c-Caspase3的表达从而抑制心肌凋亡;并通过抑制ROS/NFκB的激活抑制炎症反应;DDNA通过抑制心肌细胞旁分泌TGF-β1抑制成纤维细胞分化,并能拮抗Ang Ⅱ诱导的成纤维细胞迁移。结论:1、对天然多肽Ang1-7进行自组装修饰,获得稳定性更好的SAA1-7多肽材料。2、构建了以SAA1-7与Tel为基础的双药纳米组装体DDNA,该组装体具有良好的稳定性、载药率及生物相容性。3、DDNA具有AT1R介导的靶向心脏梗死区域的能力。4、DDNA可抑制心肌细胞凋亡相关蛋白的表达,抑制心肌细胞ROS/NFκB相关炎症激活,抑制成纤维细胞迁移,抑制心肌细胞旁分泌介导的成纤维细胞分化,从而改善心梗小鼠的心功能。
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