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自2005年以来我国福建、江苏、广东等鸭养殖区域出现一种以肝脏不规则坏死和出血、脾脏斑块状坏死出血为主要特征的严重危害养鸭业的新型传染病,其病原被证实为新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus,NDRV）。NDRV与番鸭呼肠孤病毒（Muscovy Duck Reovirus,MDRV）组成鸭呼肠孤病毒（DRV）的两种基因型。NDRV与MDRV均能够引起免疫抑制,不仅会造成雏鸭大量发病死亡、耐过鸭成为僵鸭从而严重影响生产性能,还使得感染鸭对其他病原的继发感染和共感染可能性增加、死亡率升高,对我国养鸭业造成了严重危害。为了研究广西NDRV的流行毒株的生物学特性,以及建立一种能够同时检测NDRV与MDRV单独感染或共感染的新型检测方法,本研究将开展NDRV的分离与鉴定,以及建立基于高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting,HRM）分析技术的可鉴别检测NDRV与MDRV实时荧光定量PCR检测方法。具体研究内容如下:本研究从广西桂林某鸭场一例疑似NDRV引起雏鸭感染的临床病例中采集脾脏样品,参考文献方法进行NDRVσB部分基因片段的RT-PCR检测,对扩增出NDRV的特异性条带进行基因克隆测序与分析。然后用处理后的病料经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚进行病毒分离培养,并用分离毒株感染BHK-21细胞进行培养特性、氯仿敏感性、热敏感性等生物学特性研究。最后以100 ELD50（0.2m L）病毒液通过点眼滴鼻方式人工感染1日龄樱桃谷鸭进行动物回归试验。结果发现,从临床病例样品中扩增到586 bp的特异性条带;序列测序分析结果表明,该病毒分离株与NDRV参考毒株的核苷酸序列相似性高,其中与DRV/GX-Y7的最高,为99.49%,属于NDRV进化分支,证明分离毒属于鸭源呼肠孤病毒中的NDRV,将其命名为DRV/GX-Y5。病料接种鸡胚后引起鸡胚死亡,胚体全身及多脏器出血、发育迟缓。将病毒感染BHK-21细胞后,细胞崩解、脱落形成巨细胞团,符合NDRV培养特性。分离病毒对氯仿不敏感,对热敏感。人工感染试验结果表明,试验期间攻毒组雏鸭均出现不同程度临床表现,发病鸭表现出精神萎靡、食欲减退,偶见跛脚,死亡率为40%（6/15）。病死鸭剖检可见肝脾出血坏死灶。病理组织切片可见肝脏组织大量肝细胞变性坏死,未见正常的肝细胞结构,瘀血明显;脾脏小体结构模糊不清,淋巴细胞浸润,充血、出血严重。测定攻毒后4、7、14 d脾指数,攻毒组脾指数明显低于对照组。病毒人工感染雏鸭临床症状和病理表现与NDRV自然感染一致。参考NCBI上公布的同属鸭呼肠孤病毒两种基因型的NDRV与MDRV共有的、相对保守的S4基因片段序列,设计并合成了一对能够同时扩增出两种基因型病毒包含NDRV与MDRV基因型特异性SNP的目的片段,并具有基因型特异性Tm值的引物,以建立用于鉴别诊断NDRV与MDRV的HRM方法。本研究分别用提取的NDRV DRV/GX-Y5株和MDRV商品疫苗（CA株）核酸模板进行基因扩增克隆测序并抽提阳性质粒制备标准品,将所得的质粒标准品进行荧光扩增,建立了NDRV与MDRV的HRM鉴别诊断方法,绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和稳定性试验,以及模拟可能的共感染情况,将NDRV与MDRV质粒标准品按照4:0、3:1、2:2、1:3、0:4五种比例混合模板后检测,还对广西各地区送检的共43份疑似鸭呼肠孤病毒感染病料进行临床样品检测。结果表明,以NDRV与MDRV质粒标准品建立的方法的标准曲线方程分别为y=-3.2770x+41.42、y=-3.3433x+42.53,相关系数R~2分别为0.9992和0.9963,线性关系良好。NDRV与MDRV分型结果显示,特异性Tm值分别约为83.1℃和84.8℃,分型结果清晰准确,重复性好。应用建立的方法对常见禽病毒进行检测,未见特异性扩增和熔解峰。选择10~3-1011稀释的质粒标准品检验所建立方法对NDRV与MDRV的最低检测量,结果显示,对NDRV最低检测量为11.23copies/μL,对MDRV最低检测量为9.4 copies/μL。NDRV与MDRV批内与批间稳定性试验变异系数（CV%）均≤1.6%,重复性良好。混合质粒模板检测结果表明,不同比例的共感染均可呈现出包含NDRV与MDRV基因型特异性熔解峰的特殊熔解峰。应用所建立方法对43份疑似鸭呼肠孤病毒感染病料进行临床样品检测,NDRV与MDRV阳性检出率均高于常规PCR,证实所建立方法灵敏度极高,可以作为临床上NDRV与MDRV鉴别诊断的有效检测方法。综上,本研究从广西地区临床发病鸭成功分离出一株NDRV DRV/GX-Y5株,并对其部分生物学特性和遗传进化进行了研究分析,同时建立了一种快速、特异、灵敏度高的NDRV与MDRV HRM鉴别诊断方法,为今后NDRV的病原学和广西地区流行情况及疫病防控等研究提供了材料和理论依据,并为NDRV与MDRV临床病例鉴别检测提供了新的技术手段。