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背景:Parthanatos,又称多聚ADP核糖聚合酶1（poly（ADP-ribose）polymerase1,PARP1）依赖性细胞死亡,是一种由PARP1过度激活诱发的非凋亡程序性细胞死亡形式,其主要生化特征是凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）依赖的DNA降解。细胞核中的PARP1在检测到DNA双链断裂损伤后,可以利用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）作为底物合成多聚ADP核糖（poly（ADP-ribose）,PAR）聚合物,后者转移到胞浆后诱导AIF从线粒体上释放,随后AIF募集巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）并转位到细胞核,引起不可逆的DNA降解,造成细胞死亡。AIF的核转位是parthanatos过程中的关键环节,先前的研究表明PARP1过度激活后产生的PAR聚合物是parthanatos过程中引起AIF核转位的主要原因,但目前尚不清楚PARP1是否通过调控其他信号诱导AIF的核转位。线粒体呼吸链复合体Ⅰ是氧化呼吸链的第一个蛋白质复合体,其功能是将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化为NAD+,并将获取的电子传递给泛醌。除了在氧化磷酸化系统中发挥重要功能,线粒体呼吸链复合体Ⅰ也是线粒体超氧化物的主要产生位点,其活性增强可以促进线粒体超氧化物的产生。鉴于线粒体超氧化物积累是诱导AIF从线粒体释放并转位到细胞核的关键因素之一,我们推测线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性增强可能会促进parthanatos过程中AIF的核转位。Tax1结合蛋白1（Tax1-binding protein 1,TAX1BP1）是一种在脑细胞中高表达的蛋白,它在不同类型的肿瘤中发挥的作用截然不同。在肝癌和胰腺癌中,TAX1BP1可以抑制肿瘤的发生与发展,降低肿瘤细胞的耐药性;在胃癌、乳腺癌中,它可以促进肿瘤细胞的存活,增强其耐药性。然而,TAX1BP1在胶质瘤中发挥的作用尚不明确。作为一种胞浆蛋白,TAX1BP1可以定位于膜电位下降或超氧化物积累的线粒体上,但其能否调控线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性尚不明确。脱氧鬼臼毒素（Deoxypodophyllotoxin,DPT）是一种具有抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗炎、抗血小板聚集和抗肿瘤等多种药理作用的天然化合物。本课题组的前期研究中发现DPT可以诱导胶质瘤细胞发生parthanatos,但其具体调控机制尚不明确。深入探讨DPT诱导parthanatos的调控机制,不仅能为parthanatos的分子机制研究提供参考,还可以为DPT的临床应用提供理论依据。目的:采用人胶质瘤细胞系U251,U87 MG和U118 MG以及裸鼠异体移植瘤模型,探究TAX1BP1在DPT诱导的胶质瘤细胞parthanatos过程中的作用及机制。方法:1.乳酸脱氢酶释放实验检测DPT诱导胶质瘤细胞死亡程度以及Mn TBAP、鱼藤酮、NAD+、FK866等抑制剂和使用si RNA敲低TAX1BP1对DPT诱导细胞死亡的影响;2.Western blotting检测DPT处理后胶质瘤细胞内TAX1BP1、parthanatos相关蛋白、线粒体呼吸链复合体Ⅰ亚基蛋白和DNA双链断裂损伤相关蛋白水平的变化,以及各抑制剂对上述变化的影响;3.免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察DPT对胶质瘤细胞TAX1BP1、AIF和ND1蛋白定位和表达水平的影响;4.使用si RNA下调TAX1BP1、PARP1和ND1的表达水平,研究其对DPT诱导胶质瘤细胞parthanatos相关指标变化的影响;5.流式细胞术结合JC-1染色检测DPT处理后胶质瘤细胞线粒体膜电位的变化,以及Mn TBAP、鱼藤酮和使用si RNA敲低TAX1BP对上述变化的影响;6.Mito SOX探针染色后、荧光显微镜观察DPT处理后胶质瘤细胞线粒体超氧化物水平的变化,以及各抑制剂对上述变化的影响,并使用酶标仪检测各组的荧光强度数值;7.DCFH-DA探针染色后、荧光显微镜观察DPT处理后胶质瘤细胞ROS水平的变化,以及各抑制剂对上述变化的影响,并使用酶标仪检测各组的荧光强度数值;8.线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性检测试剂盒检测DPT处理后胶质瘤细胞氧化NADH速率的变化,以及各抑制剂对上述变化的影响;9.免疫共沉淀实验检测DPT对胶质瘤细胞ND1与ND2、NDUFS2、NDUFS4相互作用的影响;10.利用能量代谢分析仪Seahorse XF-24检测线粒体耗氧率变化,反映DPT对胶质瘤细胞线粒体氧化磷酸化能力的影响;11.使用RT-q PCR检测转染TAX1BP1 si RNA以及DPT处理后胶质瘤细胞内TAX1BP1的m RNA水平变化;12.NAD+检测试剂盒检测DPT处理后细胞内NAD+水平的变化,以及各抑制剂对上述变化的影响;13.通过Balb/c裸鼠接种人U87 MG细胞构建胶质瘤皮下移植瘤模型,腹腔注射DPT观察药物对于皮下肿瘤体积变化的影响,利用Western blotting、NAD+检测试剂盒以及复合体Ⅰ活性检测试剂盒检测肿瘤组织内parthanatos相关指标的变化,利用H2O2检测试剂盒检测DPT对肿瘤组织中活性氧水平的影响。结果:1.TAX1BP1促进DPT诱导的胶质瘤细胞AIF核转位;（1）DPT诱导了胶质瘤细胞PARP1、PAR表达水平上调、线粒体膜电位下降以及AIF核转位,提示细胞发生了parthanatos死亡;（2）DPT诱导TAX1BP1转录水平增加,并从胞浆转位到线粒体;使用si RNA下调TAX1BP1的表达水平可抑制DPT诱导的线粒体膜电位下降、AIF核转位和细胞死亡,提示TAX1BP1通过调控AIF核转位促进了DPT诱导的胶质瘤细胞parthanatos死亡。2.TAX1BP1通过调控线粒体超氧化物水平促进AIF核转位;（1）DPT诱导了胶质瘤细胞线粒体超氧化物积累;使用Mn TBAP抑制超氧化物的产生可以抑制DPT诱导的线粒体超氧化物积累、线粒体膜电位下降、AIF核转位以及细胞死亡,提示线粒体超氧化物促进了DPT诱导的AIF核转位;（2）使用si RNA下调TAX1BP1的表达水平可以抑制DPT诱导的线粒体超氧化物积累,提示TAX1BP1通过调控线粒体超氧化物促进DPT诱导的AIF核转位。3.TAX1BP1通过激活线粒体呼吸链复合体Ⅰ促进线粒体超氧化物积累;（1）DPT增强了胶质瘤细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性,上调了复合体Ⅰ蛋白亚基的表达水平,促进了复合体Ⅰ的组装;使用鱼藤酮或ND1 si RNA抑制复合体Ⅰ活性可以抑制DPT诱导的线粒体超氧化物积累以及AIF核转位,提示复合体Ⅰ激活可以促进线粒体超氧化物积累和AIF核转位;（2）使用si RNA下调TAX1BP1的表达水平抑制了DPT诱导的复合体Ⅰ活性增强,复合体Ⅰ蛋白亚基的表达上调以及组装增加,提示TAX1BP1通过激活复合体Ⅰ促进线粒体超氧化物积累;（3）使用si RNA下调TAX1BP1的表达水平抑制了DPT诱导的线粒体过氧化氢酶（catalase）和GPX4蛋白水平下调。提示TAX1BP1可以通过调节过catalase和GPX4蛋白水平促进线粒体超氧化物的积累。4.PARP1促进DPT诱导的TAX1BP1线粒体转位;（1）使用PARP1抑制剂3-AB和PARP1 si RNA不仅可以抑制DPT诱导的PARP1和PAR水平上调,还可以抑制DPT诱导的TAX1BP1线粒体转位,提示PARP1激活促进了TAX1BP1的线粒体转位;（2）使用PARP1抑制剂3-AB和PARP1 si RNA抑制了DPT诱导的复合体Ⅰ蛋白亚基的表达上调、复合体Ⅰ活性的增强以及线粒体超氧化物积累,提示PARP1是TAX1BP1的上游信号,可以调控TAX1BP1诱导的复合体Ⅰ活性增强和超氧化物积累。5.PARP1依赖的NAD+耗竭促进了DPT诱导的TAX1BP1线粒体转位;（1）DPT诱导了胶质瘤细胞NAD+水平降低,该作用可被PARP1抑制剂3-AB所抑制,提示DPT诱导胶质瘤细胞发生PARP1依赖的NAD+耗竭;（2）外源性补充NAD+可以抑制DPT诱导的NAD+耗竭,而使用小分子化合物FK866抑制NAD+的再生可以加剧DPT诱导的NAD+耗竭。DPT诱导的TAX1BP1线粒体转位、复合体Ⅰ蛋白亚基的表达上调、复合体Ⅰ活性的增强、线粒体超氧化物的积累以及细胞死亡均被外源性补充NAD+所抑制,但被FK866所促进,提示PARP1依赖的NAD+耗竭促进了TAX1BP1的线粒体转位,并调控了TAX1BP1诱导的复合体Ⅰ活性增强和线粒体超氧化物积累。6.线粒体超氧化物通过诱导ROS依赖的DNA双链断裂促进PARP1激活;（1）DPT可以诱导胶质瘤细胞ROS水平增加,使用Mn TBAP抑制超氧化物的产生可以抑制DPT诱导的ROS积累,提示线粒体超氧化物促进了DPT诱导的ROS积累;（2）DPT可以诱导胶质瘤细胞DNA双链断裂相关蛋白水平上调以及PARP1和PAR水平上调,使用Mn TBAP抑制超氧化物的产生可以抑制DPT诱导的上述变化,提示线粒体超氧化物通过诱导ROS依赖的DNA双链断裂促进了PARP1激活;（3）使用鱼藤酮或ND1 si RNA抑制复合体Ⅰ的活性可以抑制DPT诱导的ROS积累、DNA双链断裂相关蛋白水平上调以及PARP1和PAR水平上调,提示由复合体Ⅰ激活产生的超氧化物通过诱导ROS依赖的DNA双链断裂促进了PARP1激活。7.DPT可以抑制皮下荷瘤裸鼠肿瘤体积的增长,肿瘤组织中parthanatos相关蛋白水平、NAD+水平、TAX1BP1、复合体Ⅰ活性、ROS水平和DNA双链断裂相关蛋白水平的变化与体外实验一致。结论:1.DPT通过诱导PARP1的过度激活引起胶质瘤细胞NAD+耗竭,NAD+耗竭促进TAX1BP1从胞浆转位到线粒体。2.TAX1BP1通过上调线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性诱导线粒体超氧化物的积累,进而促进DPT诱导的胶质瘤细胞AIF核转位。3.TAX1BP1介导的线粒体超氧化物积累可以通过诱导ROS依赖的DNA双链断裂正反馈促进DPT诱导的PARP1激活。4.在parthanatos过程中,TAX1BP1是PARP1激活后的一个下游信号,可以通过上调线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性,促进DPT诱导的胶质瘤细胞AIF核转位。