一、目的子宫内膜癌是严重威胁女性健康的生殖道恶性肿瘤,肿瘤转移是其治疗失败的主要原因,上皮间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移中的一个重要机制,EMT最早是胚胎发育中的一个重要步骤,但在肿瘤的发生发展中也会通过EMT,使肿瘤细胞丢失了部分上皮细胞特性的同时获得一些间质细胞特性,从而具有了更强的侵袭和转移能力,故探寻有效抑制EMT的治疗靶点,是针对肿瘤转移研究的新方向。真核细胞翻译起始因子 4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E),真核生物翻译起始复合物之一,是mRNA翻译起始最有效的调控因子。作为一种原癌基因,eIF4E被检测到在多种恶性肿瘤中高表达,且在EMT和肿瘤侵袭性方面表现出重要作用,但是在子宫内膜癌侵袭和转移中的研究报道较少。MicroRNA(miRNA)是一类非编码、短序列RNA,在肿瘤发生发展中充当着癌基因或者抑癌基因的作用。miRNA通过与靶mRNA的3’端非编码区域(3’untranslated region,3’UTR)互补配对导致该mRNA分子被降解或者翻译抑制,从而能够调节基因的转录及翻译。miR-320a和miR-340-5p在多种肿瘤中发挥抑制肿瘤生长、增殖,侵袭和凋亡的作用,如在肝癌、非小细胞肺癌、宫颈癌和乳腺癌等都已经证实可以抑制肿瘤的增殖或转移,但是在子宫内膜癌中的作用尚不明确,本研究旨在探讨miR-320a和miR-340-5p在子宫内膜癌转移中的作用及其机制。本课题通过收集Oncomine数据库资料,探寻eIF4E表达与子宫内膜癌发展及预后的关系,收集8例子宫内膜癌组织及癌旁正常组织,检测了其中eIF4E、miR-320a 和 miR-340-5p 的表达情况,确定了 eIF4E 与 miR-320a 和 miR-340-5p的靶向关系,并检测了 miR-320a和miR-340-5p对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的影响,用TFG-β1诱导了子宫内膜癌细胞的EMT,以检测miR-320a和miR-340-5p对子宫内膜癌侵袭和转移影响的分子机制是否和EMT有关。二、方法(一)eIF4E及miR-320a和miR-340-5p在人子宫内膜癌组织及细胞中的表达研究1、Oncomine数据库资料收集分析通过收集并分析Oncomine数据库资料,进行Kaplan-Meier生存曲线分析探讨eIF4E与子宫内膜癌预后的关系,并分析数据库中eIF4E表达与子宫内膜癌病理学分级的关系.2、eIF4E在子宫内膜癌及癌旁组织中的表达收集8例子宫内膜癌组织及癌旁正常组织,western blotting检测各组织中eIF4E的表达情况。3、miR-320a和miR-340-5p在子宫内膜癌组织及癌旁组织中的表达检测应用qRT-PCR技术检测8例子宫内膜癌组织及癌旁组织中的miR-320a和miR-340-5p的表达情况。4、eIF4E在不同子宫内膜癌细胞系中的表达水平检测Western blotting检测HEC-1A、Ishikawa、RL95-2三种不同分化水平子宫内膜癌细胞系中eIF4E的表达水平5、miR-320a和miR-340-5p在不同子宫内膜癌细胞中的表达水平检测qRT-PCR检测HEC-1A、Ishikawa、RL95-2 三种细胞中 miR-320a 和 miR-340-5p的表达水平。(二)miR-320a 和 miR-340-5p 与 eIF4E 靶向关系研究1、miRNA在线分析软件预测miR-320a和miR-340-5p与eIF4E的靶向关系。2、pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR 载体构建NCBI中得到eIF4E-3’UTR序列,设计特异性引物并行PCR扩增,双酶切后克隆至pcDNA-GFP载体中,构建pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR重组载体。3、miR-320a 和 miR-340-5p 影响 eIF4E 表达的检测将pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR 重组载体分别与 miR-320a mimics 和 miR-340-5p mimics共转染至子宫内膜癌细胞中,荧光显微镜检测GFP荧光表达情况,流式细胞术检测GFP阳性细胞率,Western blotting检测eIF4E和磷酸化形式phospho-eIF4E(p-eIF4E)的表达情况。(三)miR-320a和miR-340-5p对子宫内膜癌细胞生物学行为影响的检测将 miR-320a、miR-340-5p 以及突变体 mutant-miR-320a(mu-320a)、mutant-miR-340-5p(mu-340-5p)分别转染至 HEC-1A 和 RL95-2 细胞后,transwell 细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化,划痕实验检测细胞迁移能力的变化,并用MTT实验、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞增殖和凋亡情况。(四)miR-320a和miR-340-5p抑制子宫内膜癌细胞转移能力分子机制研究1、Western blotting检测miR-320a 和 miR-340-5p 转染 HEC-1A 细胞后 MMP-3和MMP-9的变化将 miR-320a 和 miR-340-5p 分别转染 HEC-1 A 细胞后,western blotting 检测MMP-3和MMP-9表达的变化。2、检测miR-320a和miR-340-5p对TGF-β1诱导的EMT的影响0、5、10、20ng/ml 的 TGF-β1 分别作用 HEC-1A 细胞 48 h,western blotting检测TGF-β1诱导细胞发生EMT后eIF4E及p-eIF4E表达情况。并检测miR-320a和miR-340-5p的转染对TGF-β1诱导的p-eIF4E表达变化的影响。3、检测miR-320a和miR-340-5p对TGF-β1诱导的EMT相关细胞行为的影响光镜检测miR-320a和miR-340-5p对TGF-β1诱导的子宫内膜癌细胞间质化形态的影响。细胞划痕实验检测TGF-β1诱导后子宫内膜癌细胞迁移能力的变化及miR-320a和miR-340-5p对这种变化的影响。4、检测miR-320a和miR-340-5p对TGF-β1诱导的EMT相关分子变化的影响为了进一步研究miR-320a和miR-340-5p对TGF-β1诱导的EMT影响的分子机制,western blotting 检测 miR-320a/miR-340-5p 对 TGF-β1 诱导的子宫内膜癌细胞EMT相关分子Snail、E-cadherin、α-SMA表达变化的影响。三、结果(一)eIF4E及miR-320a和miR-340-5p在子宫内膜癌组织和细胞中的表达情况1、eIF4E高表达与子宫内膜癌不良预后和高病理学分级有关Oncomine数据库资料进行Kaplan-Meier生存曲线分析,结果显示子宫内膜癌患者中高表达eIF4E与不良预后呈正相关(P<0.05),eIF4E表达水平与肿瘤分级相关性分析结果显示,eIF4E的表达水平随子宫内膜癌病理学级别升高而升高,与子宫内膜癌的高分级显著相关(P<0.01)。2、eIF4E在子宫内膜癌组织中的表达高于癌旁组织Western blotting检测结果显示子宫内膜癌组织中eIF4E的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(p<0.05)。3、miR-320a和miR-340-5p在子宫内膜癌组织中表达降低qRT-PCR结果显示,8例子宫内膜癌组织中两种miR-320a和miR-340-5p的相对表达水平都较对应癌旁组织的中有不同程度的降低,差异有统计学意义(p<0.05)。4、eIF4E表达水平在人子宫内膜癌HEC-1A细胞(中度分化)和RL95-2细胞(低度分化)中高于Ishikawa细胞(高度分化)Western blotting检测结果显示HEC-IA和RL95-2细胞中eIF4E表达水平显著高于 Ishikawa 细胞(p<0.05)。5、miR-320a和miR-340-5p表达水平在HEC-1A细胞和RL95-2细胞中表达水平低于Ishikawa细胞qRT-PCR 结果显示,HEC-1A 和 RL95-2 细胞中 miR-320a 和 miR-340-5p 的表达水平均低于Ishikawa细胞(p<0.05)。(二)eIF4E 是 miR-320a 和 miR-340-5p 作用的直接靶点,miR-320a 和 miR-340-5p 抑制 eIF4E 和 p-eIF4E 的表达。1、Tatgetscan 预测发现,eIF4E 的 3’UTR 上存在 miR-320a 和 miR-340-5p 的结合位点。2、pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR 与 miR-320a 或 miR-340-5p mimics 共转染至子宫内膜癌细胞48 h后,miR-320a和miR-340-5p均可以使GFP荧光强度和荧光表达阳性细胞率降低。3、Western blotting 结果显示,miR-320a 和 miR-340-5p 均能够降低 eIF4E 的表达水平,同时也能够有效地降低p-eIF4E的表达水平。(三)miR-320a和miR-340-5p抑制子宫内膜癌细胞侵袭和转移,抑制增殖并促进凋亡,且在不同子宫内膜癌细胞系中作用不同。1、miR-320a和miR-340-5p有效抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞的侵袭和转移Transwell侵袭实验结果显示,miR-320a和miR-340-5p均能显著抑制HEC-1A细胞的侵袭能力,对RL95-2细胞的侵袭能力影响作用不显著;细胞划痕实验结果显示,和对照组相比较,miR-320a和miR-340-5p均能显著的抑制HEC-1A细胞的迁移能力。2、miR-320a和miR-340-5p有效抑制子宫内膜癌RL95-2细胞的增殖并促进凋亡MTT结果显示,和对照组及突变组比较,miR-320a和miR-340-5p均能有效抑制RL95-2细胞的增殖能力,但是对HEC-1A细胞增殖的影响作用不明显;Annexin V-FITC/PI双染结果显示出了同样的趋势,即miR-320a和miR-340-5p能够有效的促进RL95-2细胞的凋亡,但对HEC-1A细胞的凋亡没有明显的影响。(四)miR-320a和miR-340-5p抑制子宫内膜癌细胞转移的机制和抑制MMP-3、MMP-9表达以及逆转TFG-β1诱导的EMT相关。1、Western blotting 结果显示 miR-320a 和 miR-340-5p 转染 HEC-1A 细胞后MMP-3和MMP-9表达水平下降。2、10ng/mL 的 TGF-β1 可上调 p-eIF4E 的表达,miR-320a 或 miR-340-5p 的转染均可抑制此上调作用。3、miR-320a或miR-340-5p可逆转TFG-β1诱导的EMT相关细胞行为。TFG-β1作用HEC-1A细胞48 h后,细胞呈现成纤维细胞样外观,变为长梭形条索状,但是当加入miR-320a或miR-340-5p处理后长梭形不再明显,细胞趋于正常形态。细胞划痕实验结果显示,TFG-β1诱导后细胞迁移能力增强,但是miR-320a或miR-340-5p可抑制这种现象。4、miR-320a或miR-340-5p可逆转TFG-β1诱导的EMT相关分子的变化。TGF-β1诱导后子宫内膜癌细胞EMT相关分子Snail、E-cadherin、α-SMA表达变化均能被miR-320a或miR-340-5p逆转,最后,我们应用针对eIF4E的siRNA进行对照,结果与miR-320a或miR-340-5p的作用表现出了相同的趋势。结论:1.eIF4E参与了子宫内膜癌的发生发展,高表达eIF4E与子宫内膜癌的不良预后和高分级有关。2.miR-320a或miR-340-5p表达水平的降低与子宫内膜癌的发生发展密切相关。3.eIF4E 是 miR-320a 或 miR-340-5p 的靶基因,miR-320a 或 miR-340-5p 可有效抑制eIF4E和p-eIF4E的表达。4.miR-320a或miR-340-5p通过靶向调节eIF4E有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,并且在不同的细胞系中表现出不同的作用。5.miR-320a或miR-340-5p可有效抑制HEC-1A的侵袭和转移能力。其机制和miR-320a或miR-340-5p通过靶向抑制p-eIF4E进而下调MMP-3和MMP-9表达以及逆转TGF-β1诱导的EMT有关。