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背景:衰老是一种复杂而必然的生物学过程,可导致一系列特征性的改变,如器官的生化、结构和功能改变,成熟后死亡率的增高,生理功能的逐渐降低及对周围环境应激能力的逐渐减弱等,最终导致对疾病易感性和易受损性。目前关于衰老的可能机制主要有氧化应激,兴奋性毒性,能量衰竭,炎症以及细胞凋亡,其中能量衰竭和线粒体机能障碍可能在衰老的发展中起着重要的作用。
女性雌激素撤退后,整个机体发牛加速退变(衰老),其中以中枢神经系统和心脑血管系统较明显,并受到研究者的重视。大量的研究已经表明雌激素具有中枢神经的保护作用,雌激素撤退与女性围绝经期后神经退行性变的发生以及AD的发病可能存在一定关系,而雌激素替代治疗(Estrogen response therapy,ERT)可以降低绝经期女性AD的发病风险。但是长期使用雌激素,可使患者增加乳腺癌、子宫内膜癌等疾病的患病风险。因此,寻找更为安全有效的药物对神经退行性变以及AD的防治具有重要意义。本课题组长期的研究结果也提示雌激素、植物雌激素具有中枢神经系统的保护作用。
对于神经退行性疾病的诊断,目前丰要依靠临床症状和评分量表,并辅助影像学检查,但是要明确诊断还需要病理学检查,在临床中难以应用。因此,我们尝试着寻找一种简便有效的替代检测方法以便能更好的诊断神经退行性疾病。同一机体内,血小板与神经元有较大的类似,相对于前述的诊断方法,血小板易于采集,且血小板线粒体机能变化在很大程度上能反映神经元以及整个机体的机能,因此可能成为一种简便有效的检测方法。根据本课题组长期的实验结果,我们认为线粒体机能减退在中枢神经退行性疾病过程中发挥了重要作用,雌激素撤退导致神经元退行性变的机制也与线粒体变化有关,并且雌激素及植物雌激素对神经系统的保护作用可能通过线粒体机制而实现,而观察血小板线粒体的机能变化能简便有效的反映神经元线粒体机能。
目的:本实验为建立体内、外血小板线粒体相关的衰老和药物研究模型,初步探索动物体外血小板线粒体的生物活性及雌激素和植物雌激素对其影响。采用大鼠血小板体外模型,①观察不同时间点体外血小板数量、线粒体膜电位(mitochonddrial membrane potential,△ψm)和血小板ATP含量;②雌激素和植物雌激素孵育后对两者的影响;③观察人神经纤维母细胞(SH-SY5Y)不同时间点的线粒体膜电位作为参照;④观察温度对血小板线粒体膜电位检测的影响。本实验旨在采用大鼠体外血小板,初步建立线粒体机能相关的研究模型,并探讨药物对血小板线粒体的作用,为人体线粒体机能相关的研究提供理论基础。
方法:第一部分:雌性SD大鼠12只用于雌激素作用时间点的体外血小板数量检测,用完全随机分组法分为1/2、1、2、4、6、8h和1、2、4、8、16d 11个时间组,每个时间点分别有空白对照(Control)组、苯甲酸雌二醇(EB)用药组与金雀异黄酮(Gs)用药组3个分组,每个分组6个样本。
第二部分:雌性SD大鼠12只用于雌激素作用时间点的体外血小板△ψm检测,用完全随机分组法分为1/2、1、2、4、6、8h和1、2、4、8、16d 11个时间组,每个时间点分别有空白对照(Control)组、苯甲酸雌二醇(EB)用药组与金雀异黄酮(Gs)用药组3个分组,每个分组6个样本。
第三部分:SH-SY5Y细胞用完全随机分组法进行△ψm检测分为1/2、1、2、4、6h 5个时间组,每个时间组再分为空白对照(Control)组和苯甲酸雌二醇(EB)用药组2个分组,每个分组3个样本。
第四部分:雌性SD大鼠25只用于雌激素作用时间点的体外血小板ATP含量的检测,用完全随机分组法分为1、2h和1、2、4、8d 6个时间组,1和2h时间组分别有空白对照(Control)组、苯甲酸雌二醇(EB)用药组与金雀异黄酮(Gs)用药组3个分组,每个分组4个样本。其余4个时间组有空白对照(Control)组,每组5个样本。
第五部分:雌性SD大鼠9只用于不同温度下体外血小板△ψm的检测,用完全随机分组法分为37℃、32℃、20℃和4℃4个温度组,每个温度组分别有空白对照(Control)组、苯甲酸雌二醇(EB)用药组与金雀异黄酮(Gs)用药组3个分组,每个分组6个样本。
结果:①不同时间点下,血小板数量、线粒体膜电位和血小板ATP随着时间的增加而逐渐降低(P<0.05),1d后各组较1d内的均数分别降低65.48%、15.19%和66.22%。提示血小板的量、活性和功能在体外过程中均会逐渐衰退。
②不同温度下,以37℃组为对照,血小板线粒体膜电位在4℃较低(P<0.05),Control和Gs组较之分别降低46.69%和35.50%,在20℃最低(P<0.05),Control和Gs组较之分别降低71.45%和72.23%。提示血小板线粒体膜电位对环境温度很敏感。
③在1h时间点,雌激素和植物雌激素组的血小板线粒体膜电位及ATP含量均明显高于对照组(P<0.01),分别高出23.08%和19.66%,显示雌激素和植物雌激素增强血小板线粒体活性的时间点在孵育1h左右,在SH-SY5Y细胞组中,出现差异的时间点是在2h、4h和6h,提示血小板线粒体与细胞线粒体对药物反应的基本一致。
结论:①血小板在体外过程中,血小板数量、线粒体膜电位和血小板ATP含量在1d后均逐渐下降,说明血小板在体外过程中活力和机能随着时间的推移而降低,是一种凋亡的过程。提示血小板体外的凋亡过程在一定程度上类似机体衰老的过程。
②本实验发现血小板线粒体膜电位对环境温度十分敏感,提示血小板膜电位的测定需要在同一温度下进行,为将来血小板机能检测模型应用于衰老及神经系统退行性疾病的防治提供实验依据。
③血小板在体外的过程中,应用雌激素、植物雌激素孵育,在1h时间点能短时增强血小板机能,且与细胞培养药物孵育的结果基本一致,提示雌激素和植物雌激素可能直接以线粒体这一靶点发挥对血小板机能的作用。