【摘 要】
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[目的]1.了解云南省中部玉溪地区虫媒病毒的种类、分布和流行情况,为该地区蚊传虫媒病毒的防治提供依据。2.了解玉溪地区通海县2株乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）全基因组分子特征和遗传进化特征,为该地区乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）的预防及疫苗接种提供资料。3.了解玉溪地区家养动物中虫媒病毒感染情况。[方法]1.2015年在
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0500303）； 国家自然科学基金项目（31660714）；
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[目的]1.了解云南省中部玉溪地区虫媒病毒的种类、分布和流行情况,为该地区蚊传虫媒病毒的防治提供依据。2.了解玉溪地区通海县2株乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）全基因组分子特征和遗传进化特征,为该地区乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）的预防及疫苗接种提供资料。3.了解玉溪地区家养动物中虫媒病毒感染情况。[方法]1.2015年在云南省玉溪地区的通海县、华宁县、江川区、澄江县使用诱蚊灯捕捉蚊虫,蚊虫研磨后接种BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离,提取阳性分离物中总RNA、反转录合成第一链cDNA,分别使用多对虫媒病毒属通用引物或病毒特异引物进行RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析,阳性产物送测序公司进行测序,采用DNAstar、Mega X等生物信息学软件进行序列分析。2.参照基因I型JEV全基因组序列,使用Primer 5.0软件设计一套JEV全基因序列引物,对通海县2株JEV（HL-3、HL-32）进行RT-PCR扩增和测序,使用 DNAstar 中 Seqman、Megalign,GeneDoc,MegaX 等软件进行序列拼接、同源性分析、差异位点和系统进化分析。3.采用微量中和实验方法（TCID-50）对2019和2020年在玉溪通海县、华宁县和易门县等地区采集家养动物血清进行JEV（HL-3株）和盖塔病毒（Getah virus,GETV）（NM20株）中和抗体检测。[结 果]1.在玉溪4个县区共采集蚊子13050只,分261批进行研磨,95批在金黄色地鼠肾细胞（BHK-21细胞）和/或白纹伊蚊细胞（C6/36细胞）上产生不同的细胞病变,采用多种虫媒病毒引物进行病毒鉴定,鉴定结果显示它们为JEV、版纳病毒（Bannavirus,BAV）、GETV、西藏环状病毒（Tibetorbivirus,TIBOV）、南定病毒（Nam Dinh virus,NDiV）、阿卡斑病毒（Akabane virus,AKAV）、Ngewotan 病毒（Negewotan,NWTV）、广平病毒（Quangbinhvirus,QBV）和淡色库蚊浓核病毒（Culexpipienspallensdensovirus,CppDNV）9 种病毒,其中通海县存在6种病毒35株,华宁县存在6种病毒88株、澄江县存在2种病毒5株,江川区未分离获得病毒。TIBOV和NWTV在3个县区均分离到,NDiV在2个县区分离到,JEV、AKAV和QBV仅在通海县分离到,BAV、GETV和CppDNV仅在华宁县分离到。2.对在通海县分离的2株JEV（HL-3、HL-32）采用16对引物进行扩增,测序、拼接后均获得长度为10965个核苷酸（nt）的基因序列,包含有1个10299nt开放读码框,编码3432个氨基酸（aa）。HL-3、HL-32 2株新分离病毒与基因Ⅰ型JEV核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为93.6%～98.9%和98.0%～99.7%,而与其基因型（Ⅱ型～V型）JEV核苷酸同源性均在90%以下,氨基酸同源性在98.0%以下。遗传进化分析结果显示HL-3、HL-32与基因I-b型JEV位于同一进化簇中,提示这两株新分离病毒为基因I-b型JEV;进一步分析发现2株新分离病毒与云南省近年来流行JEV毒株处在同一较小进化分支内,提示它们之间遗传进化关系较为密切。2毒株全基因序列与JE减毒活疫苗株SA14-14-2存在56个氨基酸差异位点,其中E基因上有12个氨基酸差异位点（结构域12个、结构域Ⅱ7个、结构域Ⅲ2个、结构域外1个）,在8个与毒力相关的位点（E107,E138,E176,E177,E264,E279,E315,E439）上,有6个差异位点。3.在华宁县、通海县、易门县共采集275份猪牛羊血清。HL-3株JEV毒价为10-4.5/100 μL,NM20株GETV毒价为10-7.3/100μL,所有孔未出现细胞保护,玉溪地区采集的血清JEV和GETV中和抗体均为阴性。[结论]1.玉溪通海县、华宁县、江川区、澄江县4个县区分离鉴定出9种虫媒病毒共128株,其分布于不同区县,且各区县流行的虫媒病毒种类不同,表明该地虫媒病毒种类繁多,分布广泛。2.云南省通海县分离的2株JEV与基因Ⅰ型JEV核苷酸和氨基酸同源性最高,且与基因Ⅰ型中的基因Ⅰ-b型毒株位于同一进化簇,为基因Ⅰ-b型JEV。2毒株在E基因上与毒力相关的关键位点中有2个位点发生突变,但结构域Ⅲ的关键抗原未发生改变,SA14-14-2减毒疫苗株仍可用于该地区人群的免疫接种,预防JE的发生和流行。3.玉溪地区采集的动物血清进行JEV和GETV血清抗体中和实验未检测到这两种病毒中和抗体,但2种病毒仍对该地区人和动物有潜在的威胁,需要在该地区人或家养动物中加强这些虫媒病毒监测和检测,及早发现疾病,为该地区乃至云南省虫媒病毒病的防控提供科学依据。
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