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研究背景已有研究发现,脂质超负荷参与多种心脏相关疾病的发展,例如脂质超负荷与心肌细胞死亡、心肌重塑和心功能障碍有关。然而,其潜在的作用机制仍有待进一步研究。我们最近的研究表明,高脂饮食小鼠的心肌组织中,Junctophilin-2（JPH2）的蛋白表达下降;同时,体外使用饱和脂肪酸Palmitate（PA）处理心肌细胞后,JPH2的蛋白表达也会减少。这些结果提示,JPH2蛋白在脂质超负荷引起的心肌病中具有重要作用。研究目的探讨JPH2在维持Junctin（JCN）稳定性中的作用以及JPH2对脂质超负荷引起的心肌细胞死亡和心脏功能障碍的影响。研究方法1.脂质超负荷模型的构建和JPH2在脂质超负荷诱导心肌损伤中的作用研究:（1）体内实验:选用心肌细胞特异性过表达人类JPH2蛋白的转基因小鼠（Tg-JPH2/t TA小鼠）构建高脂饮食小鼠模型。Tg-JPH2/t TA小鼠及其同窝对照小鼠分别给予正常饮食（Normal diet,ND）或者高脂饮食（High fat diet,HFD）。喂养三个月以后,通过心脏超声检查小鼠心功能、测量心肌细胞横截面积和胶原沉积水平反映心肌组织病理学改变、检测Caspase-3活性反映心肌细胞凋亡以及蛋白质免疫印迹分析心肌组织中JPH2和JCN蛋白表达水平。（2）体外实验:分离培养新生小鼠/大鼠心肌细胞,PA处理模拟脂质超负荷状态。检测心肌细胞中JPH2和JCN的蛋白表达水平、心肌细胞胞浆钙离子水平以及心肌细胞凋亡情况。此外,通过腺病毒感染,在心肌细胞中过表达JPH2和JCN,观察其对PA引起的心肌细胞损伤的影响。2.JPH2与JCN相互作用的分析:为了探究JPH2表达水平是否会影响JCN的表达水平,我们通过腺病毒感染敲低心肌细胞中JPH2蛋白的表达,检测JCN表达是否改变。同时,腺病毒感染过表达JPH2,分析对PA引起的JCN蛋白表达的减少是否具有保护作用。此外,通过腺病毒感染敲低JCN蛋白的表达,检测JCN敲低是否参与JPH2对心肌细胞保护作用的调节。我们也应用质谱分析、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验分析JPH2和JCN在空间上的相互作用。3.探讨JCN蛋白表达下调的分子机制:通过免疫共沉淀实验检测PA处理后,JCN蛋白泛素化水平;同时,通过质谱分析,探寻PA处理后,JCN泛素化修饰过程中参与的泛素酶;此外,通过腺病毒感染过表达JPH2,观察其对JCN的泛素化修饰是否具有调节作用。4.确定JCN蛋白的泛素化位点:应用软件对PA处理后JCN蛋白的泛素化位点进行预测。同时,使用质谱分析以确定PA处理后的JCN蛋白上的泛素化位点。此外,为了进一步证实已确定的泛素化位点的作用,利用质粒从基因水平突变JCN的泛素化位点,再将质粒转染心肌细胞,检测突变的JCN是否能够抵抗PA引起的降解。研究结果1.高脂饮食可引起对照小鼠心肌重塑、心肌细胞凋亡和心功能障碍等心肌损伤的表现,同时心肌组织JPH2与JCN蛋白的表达水平降低;而经转基因过表达JPH2的小鼠,则能缓解高脂饮食导致的心肌损伤。体外研究表明,PA处理可引起心肌细胞JPH2和JCN蛋白表达水平下降、心肌细胞胞浆钙离子水平升高,同时诱导心肌细胞凋亡。腺病毒感染过表达心肌细胞中的JPH2和JCN后,能够缓解PA介导的胞浆钙离子紊乱和心肌细胞凋亡。上述结果表明,JPH2在高脂饮食或者PA引起的脂质超负荷状态下表达会下调,而JPH2对脂质超负荷引起的心肌细胞损伤具有保护作用。2.腺病毒感染敲低心肌细胞中JPH2的表达,JCN蛋白的表达也随之显著降低,并伴有心肌细胞胞浆钙离子浓度的升高和心肌细胞的凋亡。而腺病毒感染过表达JPH2,能够缓解PA引起的JCN蛋白表达的降低。此外,JPH2过表达所发挥的保护作用能够被JCN敲低所抵消,即JPH2抑制PA引起的胞浆钙离子水平升高和心肌细胞凋亡的作用被减弱。进一步分析发现JPH2和JCN存在空间上的相互作用,JPH2可通过与JCN的结合调控JCN的表达,且JPH2对心肌细胞的保护作用是由JCN所介导的。3.进一步研究JCN蛋白表达下调的分子机制发现,PA处理的心肌细胞JCN蛋白的泛素化水平显著升高;质谱分析发现PA处理心肌细胞后,泛素连接酶Mu RF1与JCN的结合增多,表明PA可通过诱导泛素连接酶Mu RF1与JCN的结合,导致JCN的泛素化及后续的降解,引起JCN蛋白表达的降低;而JPH2则通过抑制Mu RF1与JCN的相互作用,阻碍Mu RF1介导的JCN蛋白的泛素化降解,缓解PA引起的JCN表达下调。4.软件预测以及质谱分析验证显示,经PA处理后,JCN蛋白上呈现多个泛素化修饰位点（K8/K102/K107/K140）。JCN泛素化位点突变（K8R/K102R/K107R/K140R）质粒转染的心肌细胞,能够抵抗PA所引起的JCN蛋白的降解。这些结果证明PA通过促进泛素连接酶Mu RF1与JCN结合,导致JCN蛋白特定位点的泛素化修饰,进而被泛素-蛋白酶体途径降解。而JPH2通过与JCN的相互作用,阻断了JCN的泛素化位点,从而保护JCN免受PA引起的泛素化降解。结论1.JPH2过表达缓解脂质超负荷诱导的心肌细胞死亡与心功能失常;2.JPH2抑制脂质超负荷状态下Mu RF1介导的JCN蛋白的泛素化降解;3.JCN参与JPH2对脂质超负荷状态下心肌保护作用的调节。本研究发现,JPH2在脂质超负荷诱导的心肌细胞死亡和心肌功能障碍中呈现出新的作用,即:脂质超负荷通过降低JPH2蛋白的表达,从而引起JCN蛋白的泛素-蛋白酶体降解,导致心脏的病理改变。由此推测,JPH2和JCN蛋白表达的降低可能是脂质超负荷引起的心脏功能障碍的重要介质和潜在的干预靶点。