大节段负重骨缺损是临床上一个常见而又棘手的难题,不仅骨缺损量大,而且常常因为骨膜、骨髓及周围组织的毁损而缺少成骨的细胞源,易形成骨不连,遗留严重功能障碍。尤为重要的是,负重骨缺损不同于腔隙性骨缺损,不仅要求外形结构的恢复,更要求功能的重建——即能够满足负重运动所要求的生物力学性能。目前临床上仍以自体骨移植作为骨缺损修复的金标准,但取自体骨必然会造成供骨区的病残,取骨量有限。为了避免自体骨移植的种种缺陷,人们对骨替代材料进行了不懈的探索,开发出人工陶瓷、生物多聚物等材料,但由于缺乏生物活性,对大节段骨缺损的修复效果还不太理想。骨组织工程学使有成骨能力的种子细胞和具有骨传导能力的支架材料相结合,明显促进骨的再生和重塑,为大段负重骨缺损的修复提供了新的思路和方法。目前,骨组织工程研究集中在种子细胞、支架材料和二者的相互作用等方面,并在骨缺损的修复方面取得了显著进展。然而这一技术用于修复大节段负重骨缺损尚缺乏足够的实验依据,在种子细胞的获取以及体外构建组织工程骨技术方面仍有争议,更需要开发、筛选出既能满足组织工程骨需要又经济实用的支架材料。为此,我们设计更加具有临床参考意义的大动物试验模型,研究自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)复合同种异体脱钙骨基质(deminerilized bone matrix, DBM)构建组织工程骨修复大节段负重骨缺损的可行性,为组织工程骨用于临床提供实验依据。首先,通过骨髓穿刺获取MSCs,并在体外扩增、向成骨细胞诱导,获取足量有成骨潜能的种子细胞。结果显示:1、接种后4到6天,体外培养的MSCs就可观察到特异的成纤维样集落形成单位,这是干细胞的特点之一。2、以3×105/cm2 细胞密度接种的原代细胞9至12天长满单层,以1×104cells/cm2接种的传代细胞4至7天长满单层;3、MSCs表达CD105而不表达CD45. 4、MSCs成骨诱导10-12天后形成钙化结节,表达碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素,与成骨细胞的特征相符;5、流式细胞仪检查未发现培养细胞中有异常倍数染色体。其次,制备山羊DBM,并研究其与MSCs的相互作用。结果显示:1、DBM成立体网状结构,具有高孔隙率和孔隙连通率;2、MSCs能在DBM的表面和更深的孔壁上粘附<WP=9>伸展和增植;3、对一般的接种方法,当接种细胞密度超过2×106/ml时,上架细胞数即不再增加,细胞在支架上的粘附率低于75%; 3、双向接种法可使细胞上架率达到80~95%,支架上的粘附细胞数随接种细胞的密度增高而增加。再次,细胞支架复合体和DBM被分别植入羊背部肌袋内,研究其异位成骨能力。前者组织学检查观察到异位成骨,且以软骨内成骨为主、无明显炎症反应,而单纯支架材料无异位成骨;二者X线片上均未见明显的成骨影像。最后,使用山羊构建负重骨大节段缺损的动物模型,研究组织工程骨修复骨缺损的成骨和重塑过程。结果显示:1、术后4周实验组的缺损区可观察到软骨内成骨,12周骨缺损被新骨连接,24周新生骨组织重塑良好、已接近正常骨干;2、植入体内2周后,支架材料内即可观察到血管形成,12周形成丰富的血管网;3、植入4周后DBM开始吸收,12周后几乎完全吸收;5、随修复时间延长,修复组织的力学性能逐渐增强,24周达到正常的85%。综上所述,我们可以得出结论:1、MSCs的增殖能力强,并可定向诱导向成骨细胞分化,适合作为骨组织工程的种子细胞;2、DBM 具有良好的细胞和组织相容性,其生物降解性与体内的成骨过程相匹配,是组织工程骨较理想的支架材料;3、双向接种法能够显著提高种子细胞的上架率,有利于组织工程骨的体外构建;4、MSCs-DBM在体内两周后即有丰富的毛细血管形成,能够为成骨提供良好的营养;5、DBM荷载MSCs构建的组织工程骨能明显促进大段骨缺损的愈合,并且能够更快地恢复其力学性能。