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前言 急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI）是一种后果极其严重的创伤。目前脊髓损伤的基础研究主要集中脊髓损伤后脊髓的继发病理损伤的预防和逆转，且确切发病机制仍不清楚，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）作为机体细胞信号传导通路的中心产物，参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节，细胞凋亡等过程。依赖钙、磷脂和二酰基甘油激活，被激活后可参与组织损伤。Onodera H等用放射自显影技术观察脑损伤后PKC在海马CA1区放射性活性再灌流6～12小时明显升高，再灌注7天放射性核素活性下降，提示脑损伤出现PKC激活并在缺血性神经元损伤中起重要的作用，PKC与中枢神经系统损伤关系在脑损伤中报道较多，并与继发性脑损伤相关，关于PKC与脊髓损伤关系，在神经再生中报道较多，本研究旨在探讨PKC在脊髓损伤组织中活性表达情况，初步探讨ASCI后PKC早期作用的分子生物学机制及继发性脊髓损伤关系，为ASCI治疗提供一定理论依据。 实验材料与方法 一、实验材料 （一）实验动物及分组 纯系Wistar大鼠60只，由中国医科大学动物部提供，雌雄不拘，体重270±20克，随机分组：A对照组：分单纯椎板切除术后3h、6h、12h、24h、72h五个时间点，每个时间点n=6；B脊髓损伤组：分损伤后3h、6h、12h、24h、72h五个时间点，每个时间点n=6。 （二）主要试剂 1 .EGTA、EDTA 2.[r一32P]ATp 3.鱼精蛋白 4.小鼠抗大鼠PKC抗体 5.SABC试剂盒 （三）主要仪器 1.改良Allen’s打击器（自制） 2.匀浆机 3.高速低温离心机 4.蛋白定量仪 5.液体闪烁仪 二、实验方法 （一）动物模型制备 参照改良的AUen’s重物打击法制备大鼠脊髓背侧损伤模型:损伤部位为T:。节段，致伤力为50gcmf，对照组仅行全椎板切除，不损伤脊髓。 （二）取材、石蜡切片制备及组织染色 各组动物分别于伤后3h、6h、12h、24h、72h再次麻醉，以损伤区为中心取约1.ocm脊髓组织并切成两部分，一部分冻存备用，另一部分制成蜡块，石蜡切片机连续切片，分别行尼氏染色及免疫组化染色。 （三）PKC活性测定 在4℃下进行loomg冻存脊髓组织胞浆及胞膜蛋白提取后采用Folin一酚试剂法进行蛋白定量，并参考介kai法进行各样品PKC活性测定，PKC活性用放射比活性表示。 （四）统计学分析 应用计算机S玲5 10.0统计软件包辅助分析，所有数据均用平均值（又士。）表示。采用t检验比较各时间点损伤组与对照组之间差异;采用方差分析比较不同时间点损伤组的差异。实验结果 一、组织细胞学染色结果 1.对照组 光镜下各时间点尼氏染色显示脊髓前角神经元胞浆内有均匀斑块状染色的尼氏小体。免疫组化染色示各时间点脊髓前角神经元胞浆、胞膜上有散在PKC阳性颗粒沉积，胞浆着色明显。 2.损伤组 ，光镜下各时间点损伤脊髓前角神经元胞浆尼氏斑块不同程度颜色变浅、崩解，数量减少等表现。而损伤组各时间点部分脊髓前角神经元PKC阳性颗粒沉积，胞浆着色变浅，胞膜沉积明显增加 二、PKC活性检测结果 伤后不同时间脊髓损伤组与对照组脊髓组织中PKC活性变化:在伤后3h、6h、12h、24h、72h各时间点，损伤组脊髓组织胞膜PKC活性均高于对照组，而胞浆PKC活性均低于对照组，且有显著性差异，说明脊髓损伤后出现PKC移位激活，伤后约6h是移位激活高峰。讨论 一、ASCI损伤组织中PKC的表达 在本实验中我们发现对照组和损伤组脊髓前角神经元均有PKC沉积，PKC阳性反应物在对照组主要位于神经元胞浆中，而损伤组主要位于神经元细胞膜上，提示PKC在损伤后脊髓前角神经元中出现移位表达。SCI组脊髓组织胞浆PKC活性明显下降，而胞膜PKC活性明显增加。提示脊髓损伤后PKC出现移位激活，且损伤后6小时是PKC激活的高峰。PKC是一种C矿+激活，磷脂依赖性的蛋白质磷酸化酶，通常情况下PKC以无活性形式存在于组织胞浆中，当活化时，转位到膜或核，是它被激活的标志，PKC激活的胞外信号主要是通过磷脂酶系统传人胞内。 本实验中PKC于脊髓损伤早期出现移位激活，我们推测是由于脊髓损伤后生物膜去极化等的原因引起多种神经递质，如兴奋性氨基酸、乙酞胆碱的释放与其相应受体作用通过G蛋白介导机制，激活PLC从而使DG增加激活PKC，激活PKC在缺血条件下又可激活PLAZ和PLD，PLAZ和PLD又参与PKC持续激活，形成恶性循环。另外PKC的激活与细胞内caZ+积聚有关。ASCI后细胞内C扩+增高直接激活PKc，同时激活PLAZ和PLD从而参与PKC持续激活;而脊髓损伤后NO一CGMP系统与PKC系统之间维持血管舒缩的动态平衡破坏也引起PKC持续激活。 二、PKC参与继发性脊髓损伤 在本实验中我们发现脊髓损伤后PKC出现移位激活，激活PKC是否参与继发性脊髓损伤国内外文献报道较少，但在SCI病理机制中，迄今已知的所有病理现象和继发性损伤中所有的病理因素均与C扩+超载密切相关，PKC激活与钙超载关系?