基因毒性抗生素阿嗪霉素B(azinomycin B)是从链霉菌(Streptomyces sahachiroi)中分离到的杂合聚酮-非核糖体多肽类抗生素，含有一个高活性的环氧基团和一个罕见的氮杂双元环，可亲核攻击5′-d(PuNPy)-3′序列中嘌呤碱基的N7位形成DNA链间交联，使得该抗生素具有强烈的细胞毒性和广谱的抗癌细胞活性，具有开发成为新型肿瘤化学治疗剂的潜力。阿嗪霉素B是一种强烈的DNA交联试剂，其产生菌必然具有强大的自抗性保护机制，能够避免抗生素对宿主染色体的攻击。对于基因毒性类天然产物产生菌自抗性机制的研究不仅能够为基因工程改造提高抗生素产量提供研究方向，还能为耐药性问题的解决及DNA损伤的修复治疗开启新的研究思路。
　　本研究以阿嗪霉素B生物合成基因簇中与抗生素合成相关但功能未知的基因aziE、aziF、orf3(又命名为aziN)、orf8和orf10为研究对象，从中寻找与阿嗪霉素B抗性相关的因子。具体研究结果如下：
　　1.aziN是位于阿嗪霉素B基因簇右边界的一个功能未知基因，敲除aziN基因会使得阿嗪霉素B的产量显著降低，表明aziN与阿嗪霉素B的生物合成密切相关。在已缺失抗性因子orf1的突变菌株中敲除aziN降低了宿主菌对药物的抗性，将其异源表达到敏感性菌株中能够提高宿主对阿嗪霉素B抗性，表明AziN为阿嗪霉素B的一个抗性蛋白。生物信息学分析显示AziN属于Glyoxalase_2超家族，与丝裂霉素结合蛋白具有一定的同源性，推测它可能是一种抗生素结合蛋白。通过内源荧光淬灭和微量热泳动(MST)实验证实AziN能够特异性的识别阿嗪霉素B，但是与常规的药物结合蛋白通过屏蔽或失活药物来发挥抗性作用不同，体外活性检测实验发现AziN与药物结合后对药物的交联活性没有影响。EMSA实验发现以药物为媒介，AziN能够通过识别药物而特异性地结合到阿嗪霉素B交联的位点。紧接着体外的一系列DNA交联修复实验证实AziN结合交联DNA后，能够对交联位点处的磷酸二酯键进行切割，引起DNA链的断裂。例如在5′-GCC-3′交联位点处，AziN会首先切割G-G交联结构正链3′端的第一个磷酸二脂键，随后AziN继续切割G-G交联结构负链5′端的第一个磷酸二脂键，最终导致DNA双链断裂。AziN是一种新的类核酸酶，通过特异性识别和切割交联DNA，引起DNA链的断裂，从而诱导核苷切除(NER)、同源重组或非同源末端连接等修复途径的发生，为后期宿主能够大量产生阿嗪霉素B提供坚强的保护作用。
　　2.在异源宿主中，基因orf8和orf10的表达均没有改变宿主对药物的敏感性，表明Orf8和Orf10与药物的抗性机制无关。
　　3.aziE负责编码主要协助家族(MFS)转运蛋白，这类蛋白通常参与药物等小分子的外排。敲除aziE基因后，胞外的阿嗪霉素B含量明显降低，表明AziE可能参与阿嗪霉素B的外排。此外，异源表达实验显示AziE的表达能够赋予敏感宿主对阿嗪霉素B的抗性，进一步证实aziE作为药物的转运蛋白，通过将胞内产生的抗生素及时运输到胞外，显著降低胞内药物的浓度，从而保护抗生素产生菌。
　　4.AziF与乙酰辅酶A羧化酶ε亚基的氨基酸序列具有一定同源性。在阿嗪霉素B产生菌中不能够筛选到aziF的基因缺失突变菌株，只有在不产素的ΔaziB中才能筛选aziF的缺失突变菌株，暗示着aziF为阿嗪霉素B生物合成的必须因子。敲除aziF基因明显降低产生菌对阿嗪霉素B的抗性。此外，异源表达AziF可以显著增强敏感菌株对阿嗪霉素B的抗性，说明aziF为阿嗪霉素B产生菌中的又一个抗性因子。
　　本研究通过对阿嗪霉素B产生菌S.sahachiroi的自抗性系统进行深入探索，发现并证实除了已报到的抗生素结合蛋白AziR和和转葡糖基酶AlkZ(orf1编码产物)以外，aziE、aziF和aziN编码的蛋白均能够在一定程度上保护产生菌免受药物阿嗪霉素B的毒性，比较系统地解析了这个基因毒性抗生素产生菌的自抗性机制，并且发现了一个新的类核酸酶诱导的交联DNA修复机制。