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褐飞虱（Nilaparvata lugens St?l）是一种半翅目水稻专食性害虫。褐飞虱繁殖力强，种群发展速度快，对传统的化学杀虫剂或抗性水稻的适应力强，因此，其防治是目前水稻育种及害虫防治工作中的难题。自噬在维持细胞和有机体正常生理机能和应对胁迫过程中发挥重要作用，研究自噬相关基因干扰对褐飞虱的影响，分析其作为褐飞虱防治靶标的潜力，对褐飞虱防治具有重要意义。本研究根据前期褐飞虱与不同水稻品种互作的比较转录组信息，筛选出ATG1激酶复合物中的2个自噬相关基因NlATG1和NlATG13，克隆了这2个基因的cDNA全长，通过荧光定量PCR（RT-qPCR）分析了基因在褐飞虱不同龄期和不同组织部位中的表达规律。通过RNAi(RNA interference)研究了这2个基因在褐飞虱防治中的潜力。具体研究结果如下：
一、褐飞虱自噬相关基因NlATG1的克隆及功能研究
首先，利用已有的1400bp核心片段设计引物，通过RACE法克隆得到NlATG1基因的2502bp cDNA全长。经预测，NlATG1包含一个2040bp的开放阅读框，编码含679个氨基酸的蛋白质，分析表明该蛋白具有一个蛋白激酶结构域。进化分析发现不同物种的ATG1具有同源性，褐飞虱与同翅目的电光叶蝉Recilia dorsalis亲缘关系最为接近。RT-qPCR结果表明，NlATG1基因在褐飞虱的不同发育阶段均有表达，在若虫中的表达量较高，但在雌、雄成虫中表达量均较低，并且表达水平与褐飞虱翅型无关。NlATG1基因在不同组织部位中也有表达，其中，头部、中肠、卵巢和脂肪体中的表达水平较高，胸部的表达量最低。
通过显微注射法对NlATG1进行RNA干扰，结果表明干扰效果较好，在8天内干扰组的基因表达量均显著低于对照组，第4天的干扰效率最高，表达水平下降至14.6%。取干扰处理4天的褐飞虱解剖不同组织部位，经RT-qPCR分析发现NlATG1在干扰组各个组织部位中的表达量显著降低。RNAi处理导致中肠上皮细胞内的自噬泡减少，细胞里可见明显的糖原颗粒积累，线粒体的宽度和面积减小，同时，RNAi处理导致褐飞虱的ATP含量降低。干扰NlATG1基因显著降低了褐飞虱的产卵量和孵化率，被干扰目的基因的雌虫与dsGFP处理雄虫交配后，产卵量显著降低，仅为对照组（dsGFP处理雌虫与dsGFP处理雄虫交配）的3%；dsGFP处理雌虫与dsNlATG1处理的雄虫进行配对后，产卵量相对于对照产卵量无明显差异，但是孵化率仅为对照组的33.8%，表明NlATG1的RNAi影响了雄虫的生殖力。干扰NlATG1基因也显著降低了褐飞虱的存活率，尤其是羽化之后的雌虫。在羽化后第8天，对照组的雌雄虫存活率分别为86.7%和93.3%，而dsNlATG1干扰处理的雌虫和雄虫的存活率分别降为6.7%和58.3%。此外，有一部分死亡的褐飞虱蜕皮不顺利，提示该基因可能还与蜕皮有关。
二、褐飞虱自噬相关基因NlATG13的克隆及功能研究
首先，利用已有的1000bp核心序列设计引物，通过RACE法克隆得到NlATG13基因的1325bp cDNA全长。经预测，NlATG13包含一个1203bp的开放阅读框，编码含400个氨基酸的蛋白质。进化分析发现不同物种的ATG13具有同源性。RT-qPCR结果表明，NlATG13基因在褐飞虱的不同发育阶段均有表达，在3-5龄若虫中的表达量较高，但在1-2龄若虫和成虫中表达量均较低。NlATG13基因在不同组织部位中也均有表达，其中，头部、中肠和脂肪体中的相对表达量较高，胸部的表达量最低。
通过显微注射法对NlATG13进行RNAi处理，结果表明干扰效果较好，第4天的干扰效率最高，与dsGFP对照组相比，dsNlATG13处理组在4天的表达水平下降到16.9%。目的基因的RNAi处理导致中肠上皮细胞内糖原颗粒的积累以及虫体的ATP含量降低，但是没有导致自噬泡的减少。干扰NlATG13基因显著降低了褐飞虱的存活率，第10天的存活率为41.4%，对照组为85.6%。
综上所述，本研究主要克隆了2个自噬相关基因，揭示了2个基因的表达规律。并且通过RNAi初步探究了2基因的相关功能，利用中肠上皮细胞为模型研究了自噬对褐飞虱细胞和个体的影响，为今后研究不完全变态昆虫的自噬提供了新线索，也为褐飞虱防治提供了新的潜在靶标。
一、褐飞虱自噬相关基因NlATG1的克隆及功能研究
首先，利用已有的1400bp核心片段设计引物，通过RACE法克隆得到NlATG1基因的2502bp cDNA全长。经预测，NlATG1包含一个2040bp的开放阅读框，编码含679个氨基酸的蛋白质，分析表明该蛋白具有一个蛋白激酶结构域。进化分析发现不同物种的ATG1具有同源性，褐飞虱与同翅目的电光叶蝉Recilia dorsalis亲缘关系最为接近。RT-qPCR结果表明，NlATG1基因在褐飞虱的不同发育阶段均有表达，在若虫中的表达量较高，但在雌、雄成虫中表达量均较低，并且表达水平与褐飞虱翅型无关。NlATG1基因在不同组织部位中也有表达，其中，头部、中肠、卵巢和脂肪体中的表达水平较高，胸部的表达量最低。
通过显微注射法对NlATG1进行RNA干扰，结果表明干扰效果较好，在8天内干扰组的基因表达量均显著低于对照组，第4天的干扰效率最高，表达水平下降至14.6%。取干扰处理4天的褐飞虱解剖不同组织部位，经RT-qPCR分析发现NlATG1在干扰组各个组织部位中的表达量显著降低。RNAi处理导致中肠上皮细胞内的自噬泡减少，细胞里可见明显的糖原颗粒积累，线粒体的宽度和面积减小，同时，RNAi处理导致褐飞虱的ATP含量降低。干扰NlATG1基因显著降低了褐飞虱的产卵量和孵化率，被干扰目的基因的雌虫与dsGFP处理雄虫交配后，产卵量显著降低，仅为对照组（dsGFP处理雌虫与dsGFP处理雄虫交配）的3%；dsGFP处理雌虫与dsNlATG1处理的雄虫进行配对后，产卵量相对于对照产卵量无明显差异，但是孵化率仅为对照组的33.8%，表明NlATG1的RNAi影响了雄虫的生殖力。干扰NlATG1基因也显著降低了褐飞虱的存活率，尤其是羽化之后的雌虫。在羽化后第8天，对照组的雌雄虫存活率分别为86.7%和93.3%，而dsNlATG1干扰处理的雌虫和雄虫的存活率分别降为6.7%和58.3%。此外，有一部分死亡的褐飞虱蜕皮不顺利，提示该基因可能还与蜕皮有关。
二、褐飞虱自噬相关基因NlATG13的克隆及功能研究
首先，利用已有的1000bp核心序列设计引物，通过RACE法克隆得到NlATG13基因的1325bp cDNA全长。经预测，NlATG13包含一个1203bp的开放阅读框，编码含400个氨基酸的蛋白质。进化分析发现不同物种的ATG13具有同源性。RT-qPCR结果表明，NlATG13基因在褐飞虱的不同发育阶段均有表达，在3-5龄若虫中的表达量较高，但在1-2龄若虫和成虫中表达量均较低。NlATG13基因在不同组织部位中也均有表达，其中，头部、中肠和脂肪体中的相对表达量较高，胸部的表达量最低。
通过显微注射法对NlATG13进行RNAi处理，结果表明干扰效果较好，第4天的干扰效率最高，与dsGFP对照组相比，dsNlATG13处理组在4天的表达水平下降到16.9%。目的基因的RNAi处理导致中肠上皮细胞内糖原颗粒的积累以及虫体的ATP含量降低，但是没有导致自噬泡的减少。干扰NlATG13基因显著降低了褐飞虱的存活率，第10天的存活率为41.4%，对照组为85.6%。
综上所述，本研究主要克隆了2个自噬相关基因，揭示了2个基因的表达规律。并且通过RNAi初步探究了2基因的相关功能，利用中肠上皮细胞为模型研究了自噬对褐飞虱细胞和个体的影响，为今后研究不完全变态昆虫的自噬提供了新线索，也为褐飞虱防治提供了新的潜在靶标。