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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)作为一种猪病毒性传染病,在1987年于美国部分区域首次出现并报道,两年后欧洲地区也迅速爆发此病,随后在全世界的猪场形成广泛流行传播趋势,造成了巨大的经济损失。引发PRRS的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。除弱毒疫苗免疫外,对于PRRS的防控与净化目前还没有较好的方法,因此需要进一步研究PRRSV免疫机制从而对其进行有效防治。在病原体入侵过程中,宿主会通过天然免疫应答和适应性免疫应答来保护宿主。宿主天然免疫应答中的I型干扰素(type I Interferons,IFNs)结合细胞表面的受体后通过刺激细胞上调数百种干扰素刺激基因(Interferon-stimulated Genes,ISGs)来激活细胞进入抗病毒状态。在这些ISGs中,泛素样蛋白ISG15是产生最早和表达量最高的ISGs之一。与泛素相似,ISG15可通过酶级联反应与靶蛋白共价结合,但同时ISG15可以单体形式被释放至细胞外。有报道称,重组或细胞外游离ISG15具有细胞因子的作用,可以刺激NK细胞的增殖、刺激IFN-γ的产生、诱导DC分化成熟、也可作为中性粒细胞的趋化因子发挥功能。然而,作为一种细胞内的抗病毒蛋白,ISG15在不同的物种间并不保守,因此ISG15作为一种细胞因子对免疫系统的作用,以及在病毒感染中所发挥的机制依然不明。本研究以此为出发点,通过自行表达重组猪ISG15蛋白,制备猪ISG15特异性单克隆抗体和多克隆抗体建立猪ISG15夹心ELISA检测方法,探究PRRSV与猪ISG15的相互作用,进一步探究猪ISG15作为细胞因子对PRRSV可能的调控作用。本研究的主要工作和结果如下:1.制备识别猪ISG15的单克隆抗体并进行了功能鉴定:首先构建原核表达载体p ET28a-ISG15并在大肠杆菌中诱导表达并纯化了His标记的猪ISG15蛋白,通过使用重组蛋白免疫Balb/c小鼠后采集脾脏进行细胞融合,并通过ELISA筛选,Western blot筛选及亚克隆,获得1株稳定分泌ISG15抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D5E6。经过Balb/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞获得腹水,纯化后通过抗体亚型鉴定试剂盒鉴定3D5E6抗体亚型为Ig G1。Western blot和IFA检测3D5E6可识别猪IFN-α刺激CRL2843细胞所表达产生的内源性ISG15。2.猪ISG15双抗夹心ELISA检测方法的建立:委托南京金斯瑞公司使用纯化后猪ISG15蛋白免疫新西兰白兔,通过抗原亲和层析获得识别猪ISG15的兔多克隆抗体。以鼠源3D5E6作为捕获抗体,兔多抗作为检测抗体,以猪ISG15蛋白为标准品,通过棋盘滴定法确定了猪ISG15双抗夹心ELISA方法的最适反应条件及夹心抗原的最低检测限度,并绘制出标准曲线。优化后的双抗夹心ELISA检测条件为:捕获抗体包被量8μg/孔,检测抗体稀释比例为1:4000,最低检测下限为250 pg/m L。3.不同毒力PRRSV毒株感染PAMs后ISG15表达水平的差异:用PRRSV不同毒株(强毒,弱毒)感染PAMs 24 h后,收取细胞检测猪ISG15 m RNA和蛋白水平的变化。同时收取细胞上清液,利用猪ISG15双抗夹心ELISA法测定不同PRRSV毒株感染PAMs后上清中猪ISG15的表达水平。同时使用PRRSV不同毒株感染PAMs的上清液预处理VERO细胞(IFNs产生缺陷)12 h,再用对干扰素敏感的NDV-GFP感染细胞检测PAMs上清液中的IFNs活性,24 h后观察发现GFP阳性细胞数量在不同PRRSV毒株感染PAMs上清处理组中无差异,初步证明PRRSV不同毒株感染PAMs后引起ISG15在转录水平和翻译水平的表达差异不依赖于IFNs,且PRRSV弱毒株感染PAMs后可诱导高水平的猪ISG15分泌。4.重组猪ISG15对PRRSV在PAMs上复制的调控作用:对纯化后的猪ISG15蛋白和对照蛋白SUMO进行去内毒素处理,经SDS-PAGE分析去内毒素后蛋白未发生降解。分别用两种蛋白预处理PAMs 24 h,再用PRRSV-JXA1毒株感染PAMs 24 h后Western blot检测PRRSV N蛋白表达。经与对照组相比,猪ISG15蛋白刺激PAMs后能有效抑制PRRSV复制。综上所述,PRRSV弱毒株及疫苗株感染PAMs后能诱导ISG15的大量表达,而PRRSV强毒株无法诱导PAMs上ISG15的表达。PRRSV疫苗株诱导产生的内源性ISG15可被分泌释放至细胞外,通过使用重组猪ISG15刺激PAMs可抑制PRRSV增殖,说明PRRSV感染天然靶细胞PAMs后诱导ISG15表达和分泌的能力,可能是导致不同PRRSV毒株毒力差异的因素之一,本研究可对PRRSV的毒力差异和免疫调节机制以及未来的防治提供重要线索。