甜樱桃软腐病是由匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)引起的采后病害,其发病迅速,是导致甜樱桃采后贮运和货架损失的主要原因之一。传统化学防治存在农药残留、环境污染和病原菌抗药性等风险弊端,探索生物防治方法是解决这一问题的途径之一。在分子水平上阐明匍枝根霉拮抗菌的分子拮抗作用机制,可促进甜樱桃软腐病生物防治方法和技术的深入研究与应用。本试验解析了不同贮藏条件下甜樱桃表面微生物群落的动态变化,鉴定了甜樱桃采后主要致腐真菌的种类和致病性,针对软腐病菌,采用离体和活体结合筛选出内生贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),探究了贝莱斯芽孢杆菌对软腐病菌形态的影响,通过对贝莱斯芽孢杆菌与软腐病菌的全基因组和互作转录组分析,探讨了贝莱斯芽孢杆菌的生防机制。主要研究结果和结论如下:1.甜樱桃贮期表面微生物群落的演替。采用二代高通量测序技术研究了常温(25℃)和低温(0℃)贮藏条件下甜樱桃表面微生物群落的演替规律。在樱桃表面共检出9,652个细菌OTU和863个真菌OTU,Erwinia和Botrytis等显著富集在腐烂果实表面,Bacillus和Cryptococcus等菌属显著富集于未腐烂样本中,真菌对腐败更为敏感,可能在樱桃腐败过程中起着更重要的作用;温度条件对樱桃表面微生物群落组成有显著影响,常温和低温贮藏条件下,甜樱桃表面微生物群落差异显著,腐烂显著降低真菌的α多样性,细菌的α多样性变化不显著,且在常温和低温腐败过程中,真菌群落具有不同的演变方向;常温下微生物的共存网络比低温下更复杂,表明常温下微生物之间存在更多的相互作用;潜在病原菌和有益微生物之间的显著相关性表明,不仅是病原菌,微生物群落也会影响果实腐烂。2.甜樱桃采后主要病原真菌的分离鉴定与致病性评价。对山东省9个甜樱桃主产区的采后致腐真菌进行分离、纯化和鉴定,共得到88株真菌分离物,分别属于根霉属、曲霉属、镰刀菌属、裂褶菌属、青霉属、炭疽菌属、链核盘菌属、短梗霉属和篮状霉属。3株代表性病原真菌对甜樱桃的致病力由强到弱依次为匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、果生链核盘菌(Monilinia fructicola)和隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)。3.甜樱桃内生拮抗菌对软腐病菌的抑菌机制3.1甜樱桃内生拮抗菌对软腐病菌菌体形态和超微结构的影响。从健康甜樱桃果实上筛选获得内生拮抗细菌Q-84,经形态学以及16S r DNA序列鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,对匍枝根霉体外抑制率达到87.12%,体内防效达79.0%。扫描电镜和透射电镜观察发现,经与贝莱斯芽孢杆菌共培养后,匍枝根霉菌丝和孢子形态扭曲,菌丝体细胞内物质渗漏,贝莱斯芽孢杆菌对匍枝根霉具有明显的致畸作用,原因可能与贝莱斯芽孢杆菌菌株产生抑菌物质有关。3.2贝莱斯芽孢杆菌与匍枝根霉互作的分子机制。分别采用Illumina&Nanopore和Illumina&Pac Bio测序技术对贝莱斯芽孢杆菌和匍枝根霉进行全基因组测序。生物信息学分析表明,贝莱斯芽孢杆菌菌株基因组中有13个次级代谢合成基因簇,有10个基因簇通过非核糖体肽合成酶(NRPS)和聚酮化合物合酶(PKS)指导生物活性肽和聚酮化合物的合成。有5个大基因簇参与surfactin、iturin、fengycin、bacillibactin和bacilysin合成,3个基因簇指导抗菌聚酮的合成。此外,发现菌株中有编码molybdenum cofactor和butirosin的基因,这二者在不同菌株间相似性很低,molybdenum cofactor在贝莱斯芽孢杆菌中尚未报道过。贝莱斯芽孢杆菌和软腐病菌的互作转录组分析表明,共有616个差异表达基因,其中243个基因表达上调,313个基因下调。根据KEGG聚集分析,有61个基因参与到次级代谢物的生物合成,其有42个基因涉及到抗生素的合成,但是这些合成相关基因中有50%以上的基因表达显著下调,仅发现bacillaene合成基因中的pks IJ和teichuronic acid合成基因簇中的tua AGE基因表达上调。GO富集分析表明,有表达差异显著的基因主要富集在了生物学过程中的核糖核蛋白复合体组装和亚基组成及核糖体组装等一系列与核糖体活动相关的过程。可以推测,在与病原菌互作前期,贝莱斯芽孢杆菌主要通过空间和营养竞争来抑制病原菌的增殖和入侵植物宿主,达到生物防治的目的。