【摘 要】
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大黄作为我国常用中药材之一,临床应用广泛,野生资源匮乏,市场上主要以栽培品为主,栽培过程受温度、光照或海拔等环境因素影响。中药材的活性成分大多来源于药用植物的次生代谢物。活性成分的生物合成与药材品质关系密切。细胞信号转导或逆境胁迫通过作用于药用植物次生代谢物的生物合成途径,进而影响药材活性成分合成及品质形成。MYB作为植物特有的一大类转录因子家族,在植物生长发育、次生代谢或逆境适应等生命历程中发挥
【基金项目】
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国家自然科学基金（81973430）； 陕西省重点研发计划项目（2021ZDLSF04-01）； “秦药”品质评价与资源开发学科创新团队项目（2019-QN01）； 陕西省高校青年杰出人才支持计划项目； 咸阳市中青年科技领军人才项目；
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大黄作为我国常用中药材之一,临床应用广泛,野生资源匮乏,市场上主要以栽培品为主,栽培过程受温度、光照或海拔等环境因素影响。中药材的活性成分大多来源于药用植物的次生代谢物。活性成分的生物合成与药材品质关系密切。细胞信号转导或逆境胁迫通过作用于药用植物次生代谢物的生物合成途径,进而影响药材活性成分合成及品质形成。MYB作为植物特有的一大类转录因子家族,在植物生长发育、次生代谢或逆境适应等生命历程中发挥重要作用。本研究以掌叶大黄Rheum palmatum L.为对象,从1年生掌叶大黄转录数据中筛选获得6个MYB转录因子,进行蛋白理化特性、结构域或分子进化等生物信息学分析,利用q PCR检测基因响应激素和非生物胁迫的表达模式,最后在酵母中探明编码蛋白是否有转录活性,有助于下一步研究其在大黄蒽醌类活性成分合成调控中的分子作用,进而为大黄品质形成科学内涵和遗传改良研究提供理论指导。具体研究内容如下:1.基于对掌叶大黄不同组织部位转录数据差异基因分析,筛选6个具有完整开放阅读框的MYB转录因子。应用RT-PCR技术克隆验证各目标基因序列,命名为Rp MYB1、Rp MYB2、Rp MYB3、Rp MYB4、Rp MYB5、Rp MYB6,序列长度分别为1128bp、1002 bp、828 bp、738 bp、882 bp、876 bp,分别编码氨基酸数目为375 aa、333aa、275 aa、245 aa、293 aa、291 aa,并提交Gen Bank获注册号为MW269443～MW269448,蛋白结构分析显示Rp MYB1、Rp MYB2、Rp MYB5属R1-MYB亚家族,其中Rp MYB1、Rp MYB2为跨膜蛋白,Rp MYB3、Rp MYB3、Rp MYB6是典型的R2R3-MYB亚家族成员;6个MYB转录因子均属非分泌型蛋白,亚细胞定位预测一致在细胞核;系统进化分析显示Rp MYB1、Rp MYB2、Rp MYB5聚在R1-MYB亚家族,Rp MYB3、Rp MYB4聚在S4亚家族,Rp MYB6被划为S20亚家族。2.实时荧光定量进行表达模式分析Rp MYB1、Rp MYB2、Rp MYB6在根中表达量最高,Rp MYB3、Rp MYB4均在叶片中表达量最高,分别是根中的4.39、14.84倍;Rp MYB5在叶柄中表达量最高是根中2.24倍;比对Mock处理组,激素应答中ABA可诱导Rp MYB1、Rp MYB5表达分别在1 h、24 h最高是CK处理的2.63、2.66倍,Me JA能明显诱导Rp MYB6表达在24 h最高为10.30倍,抑制Rp MYB3表达在12 h最低为0.08倍,SA对Rp MYB6表达诱导最为明显在3 h处达21.84倍;受非生物胁迫处理与Mock处理组比较Rp MYB1、Rp MYB2响应高温胁迫促进最为明显在24 h分别达CK处理的16.88、5.19倍,Rp MYB3响应盐胁迫在24 h处稍有促进为1.77倍;Rp MYB4响应损伤胁迫明显促进表达在3 h处为3.91倍,Rp MYB5以损伤胁迫抑制表达最为明显在24 h为0.14倍;Rp MYB6响应盐、损伤胁迫明显抑制表达在24 h时最低均为0.09倍,但高温胁迫明显促进表达在24 h最高达4.68倍。3.构建重组表达载体Rp MYB1-p GBKT7、Rp MYB2-p GBKT7、Rp MYB3-p GBKT7、Rp MYB4-p GBKT7、Rp MYB5-p GBKT7和Rp MYB6-p GBKT7分别转化酵母AH109感受态细胞进行MYB转录因子转录活性验证,结果显示Rp MYB1、Rp MYB4、Rp MYB5明显具有转录活性,而Rp MYB2、Rp MYB3、Rp MYB6不具有或者具有微弱的单独转录活性,也可能需要和其他蛋白复合后发挥转录调控作用。
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