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植酸通常以盐的形式存在于植物中，植酸盐难以被入和单胃动物消化利用，造成动物体内营养元素缺乏。运用种子发芽激活内源植酸酶方法降解植酸盐，可以提高矿质营养素的生物利用率，同时形成的低级肌醇磷酸具有抗氧化、抗癌、降血压以及调控细胞代谢等生理作用。在豆类种子发芽过程中，植酸降解产生的磷酸基团在芽苗生长中参与能量代谢，肌醇参与细胞壁的分化与发育，由此调节芽菜生理生化变化和抵抗逆境。无机盐、有机酸等外源调节物质均能调节豆类芽菜生长，促进植酸降解，提高其营养品质。多胺既是一种植物激素，又是一种信号分子，在植物生长发育中有重要的调节作用。Ca2+作为第二信使偶联胞外信号与胞内生理反应，是植物代谢和生长发育的主要调控者。本研究从生理代谢、酶学、基因和代谢组学水平上探讨多胺和Ca2+对绿豆芽菜植酸降解代谢的调控机制，主要研究结果如下:
1、研究了多胺对绿豆芽菜植酸降解和抗氧化能力的影响。绿豆种子发芽72h时，腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)处理对植酸降解具有浓度效应，且180μMSpd作用效果最佳。Spd处理提高了SPDS(亚精胺合成酶)相对表达量，内源游离、结合和束缚态Spd含量显著增加，在发芽72h时三者分别增加104.70％、36.10％和119.66％，促进了游离态多胺向结合态和束缚态转化，提高了赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)和细胞分裂素(CTK)含量，刺激PA(植酸酶)、以P(紫色酸性磷酸酶)、肱口甲(多重肌醇磷酸酶)和ALP(碱性磷酸酶)表达量，使植酸酶和酸性磷酸酶活力在发芽72h时分别比对照提高54.27％和8.21％，植酸含量降低50.13％，无机磷含量显著增加，提高了能量代谢水平，促进植酸降解和芽菜生长，同时提高了总酚和抗坏血酸含量，以及抗氧化能力。2mM二环己胺(DCHA，亚精胺合成酶抑制剂)处理下SPDS表达量显著低于对照，内源多胺含量降低，结果则相反，外源Spd可逆转此抑制作用。Spd处理下水溶性钙含量显著增加，且与内源多胺含量呈显著正相关，与植酸含量呈显著负相关。因此，外源Spd可通过提高内源Spd含量，促进内源多胺和激素积累，促进植酸降解，提高能量代谢和绿豆芽菜抗氧化能力及其生长。
2、研究了外源Ca2+对植酸降解和钙分布的影响。6mM CaCl2处理降低了质子泵相关基因表达量，提高了Ca2+-ATPase、CaM,CDPK(钙依赖性蛋白激酶)和CCaMK(钙和钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)相对表达量，增加了绿豆芽菜子叶、真叶和胚轴细胞的细胞壁、细胞间隙、细胞膜、液泡和细胞质中钙沉淀，促进了Ca2+内流和在细胞中的转运;提高了总钙和CaM含量，水溶性钙含量显著增加，发芽72h时达到最大值，较对照提高235.02％;提高了PA、以尸和ALP相对表达量，植酸酶活力增加66.47％，植酸含量降低44.55％。因此，CaCl2可促进Ca2+内流及其在细胞中的积累，从而促进植酸降解和绿豆芽菜生长。
3、研究了Ca2+通道、IP3和CaM(钙调蛋白)对植酸降解和钙分布的影响。0.3mM三氯化镧(LaCl3，质膜钙离子通道抑制剂)处理使细胞外钙沉淀颗粒大量积累，由此抑制了胞外Ca2+内流，降低了水溶钙含量，抑制了植酸的降解。0.2mM维拉帕米(Verapamil，VP，L.型钙离子通道抑制剂)和0.05mM钌红(Ruthenium red，RR，胞内钙库钙释放抑制剂)均不同程度地改变钙沉淀分布，抑制植酸降解代谢。这三种抑制剂中RR处理对植酸降解的抑制作用最强。0.06mM磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC H中制剂新霉素(NEO)处理72h时，PI-PLC相对表达量较对照降低86.70％，导致PI-PLC活力和(1，4，5)IP3含量分别比对照降低26.94％和22.64％，使细胞外钙沉淀大量积累，由此降低了水溶性钙和CaM含量，抑制了植酸降解代谢。因此，抑制IP，的产生可抑制Ca2+跨膜行为，进而抑制植酸降解。0.04mM三氟拉嗪(Trifluoperazine，TFP，CaM拮抗剂)处理对CaM含量的影响不显著，但降低了质子泵和Ca2+靶蛋白基因相对表达量，使细胞外钙沉淀颗粒大量积累，水溶性钙含量降低，植酸降解代谢受抑。因此，抑制Ca2+信号的产生与传递，导致植酸降解受抑，CaCl2可逆转此抑制作用。
4、研究了Spd联合CaCl2对绿豆芽菜植酸降解的调节作用。单独Spd处理下细胞内和细胞外钙沉淀颗粒积累，添加6mM CaCl2后芽菜细胞内和细胞外钙沉淀颗粒继续增加，水溶性钙和总钙含量显著提高，发芽72h时分别为对照的16.77和2.39倍，同时降低了游离和结合态多胺含量，增加了束缚态多胺含量，提高了GA3、LAA、ABA和CTK含量以及H2O2含量，使植酸酶和酸性磷酸酶活力分别提高74.80％和41.98％，植酸含量较对照降低62.27％，提高了无机磷和低级肌醇磷酸含量。此作用效果显著好于单独Spd和CaCl2处理(结果1、结果2)。可见，Spd联合CaCl2处理可通过促进多胺和Ca2+的吸收和转运及多胺降解，促进植酸降解，提高能量代谢，促进胚轴细胞伸长和绿豆芽菜生长。Spd联合CaCl2处理对促进植酸降解具有协同效应。
5、研究了Spd和Ca2+在绿豆芽菜植酸降解中的相互作用。单独用DCHA处理诱导许多钙沉淀集聚在细胞外，添加6mM CaCl2后细胞外钙沉淀增加，发芽72h时水溶性钙和总钙含量分别为对照的15.54和2.15倍，促进了游离态多胺向束缚态转化，提高了激素和H2O2含量，诱导了刚尸和ALP表达，使植酸酶和酸性磷酸酶活力分别较对照提高29.80％和31.69％，植酸含量降低29.25％，逆转了DCHA对植酸降解的抑制作用，促进了细胞的伸长生长。在添加DCHA和CaCl2的基础上，再添加Spd对植酸降解影响不显著。外源Spd可以逆转LaCl3对Ca2+内流的抑制作用，Spd+La处理下芽菜细胞中无肉眼可见钙沉淀，水溶性钙含量与对照无显著差异，但游离态、结合态和束缚态多胺大量积累，其中三种形态Spd在发芽72h时分别较对照提高389.70％、281.37％和289.85％，H2O2含量显著降低，多胺降解受抑，导致GA3、ABA和CTK含量降低，植酸含量较对照提高19.35％，胚轴细胞长度明显小于对照，不能逆转LaCl3对植酸降解和芽菜生长的抑制作用。可见，在绿豆芽菜植酸降解过程中，Ca2+在Spd下游发挥作用。
6、经CaCl2、Spd和CaCl2-Spd处理的绿豆芽菜通过代谢组学分析，在pos和neg扫描模式下分别鉴定出102和87种差异代谢物，这些代谢物主要涉及氨基酸合成与代谢、酚类物质合成、萜类物质合成与降解、脂肪酸代谢、ABC转运体、叶酸合成、糖代谢、磷脂酰肌醇信号系统、激素合成、吲哚生物碱合成、核苷酸代谢及泛醌和其他萜类醌合成，含量显著降低的代谢物主要涉及糖代谢、氨基酸合成和降解途径、酚类物质合成、亚油酸代谢、嘌呤代谢及ABC转运体，含量显著增加的代谢物主要涉及激素合成途径、氨基酸代谢途径、亚麻酸代谢、吲哚生物碱合成及萜类物质的合成与降解途径。其中CE+与Spd共同增强的植酸降解代谢主要源于肌醇磷酸代谢、三羧酸循环和植物激素合成代谢的增强。
1、研究了多胺对绿豆芽菜植酸降解和抗氧化能力的影响。绿豆种子发芽72h时，腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)处理对植酸降解具有浓度效应，且180μMSpd作用效果最佳。Spd处理提高了SPDS(亚精胺合成酶)相对表达量，内源游离、结合和束缚态Spd含量显著增加，在发芽72h时三者分别增加104.70％、36.10％和119.66％，促进了游离态多胺向结合态和束缚态转化，提高了赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)和细胞分裂素(CTK)含量，刺激PA(植酸酶)、以P(紫色酸性磷酸酶)、肱口甲(多重肌醇磷酸酶)和ALP(碱性磷酸酶)表达量，使植酸酶和酸性磷酸酶活力在发芽72h时分别比对照提高54.27％和8.21％，植酸含量降低50.13％，无机磷含量显著增加，提高了能量代谢水平，促进植酸降解和芽菜生长，同时提高了总酚和抗坏血酸含量，以及抗氧化能力。2mM二环己胺(DCHA，亚精胺合成酶抑制剂)处理下SPDS表达量显著低于对照，内源多胺含量降低，结果则相反，外源Spd可逆转此抑制作用。Spd处理下水溶性钙含量显著增加，且与内源多胺含量呈显著正相关，与植酸含量呈显著负相关。因此，外源Spd可通过提高内源Spd含量，促进内源多胺和激素积累，促进植酸降解，提高能量代谢和绿豆芽菜抗氧化能力及其生长。
2、研究了外源Ca2+对植酸降解和钙分布的影响。6mM CaCl2处理降低了质子泵相关基因表达量，提高了Ca2+-ATPase、CaM,CDPK(钙依赖性蛋白激酶)和CCaMK(钙和钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)相对表达量，增加了绿豆芽菜子叶、真叶和胚轴细胞的细胞壁、细胞间隙、细胞膜、液泡和细胞质中钙沉淀，促进了Ca2+内流和在细胞中的转运;提高了总钙和CaM含量，水溶性钙含量显著增加，发芽72h时达到最大值，较对照提高235.02％;提高了PA、以尸和ALP相对表达量，植酸酶活力增加66.47％，植酸含量降低44.55％。因此，CaCl2可促进Ca2+内流及其在细胞中的积累，从而促进植酸降解和绿豆芽菜生长。
3、研究了Ca2+通道、IP3和CaM(钙调蛋白)对植酸降解和钙分布的影响。0.3mM三氯化镧(LaCl3，质膜钙离子通道抑制剂)处理使细胞外钙沉淀颗粒大量积累，由此抑制了胞外Ca2+内流，降低了水溶钙含量，抑制了植酸的降解。0.2mM维拉帕米(Verapamil，VP，L.型钙离子通道抑制剂)和0.05mM钌红(Ruthenium red，RR，胞内钙库钙释放抑制剂)均不同程度地改变钙沉淀分布，抑制植酸降解代谢。这三种抑制剂中RR处理对植酸降解的抑制作用最强。0.06mM磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC H中制剂新霉素(NEO)处理72h时，PI-PLC相对表达量较对照降低86.70％，导致PI-PLC活力和(1，4，5)IP3含量分别比对照降低26.94％和22.64％，使细胞外钙沉淀大量积累，由此降低了水溶性钙和CaM含量，抑制了植酸降解代谢。因此，抑制IP，的产生可抑制Ca2+跨膜行为，进而抑制植酸降解。0.04mM三氟拉嗪(Trifluoperazine，TFP，CaM拮抗剂)处理对CaM含量的影响不显著，但降低了质子泵和Ca2+靶蛋白基因相对表达量，使细胞外钙沉淀颗粒大量积累，水溶性钙含量降低，植酸降解代谢受抑。因此，抑制Ca2+信号的产生与传递，导致植酸降解受抑，CaCl2可逆转此抑制作用。
4、研究了Spd联合CaCl2对绿豆芽菜植酸降解的调节作用。单独Spd处理下细胞内和细胞外钙沉淀颗粒积累，添加6mM CaCl2后芽菜细胞内和细胞外钙沉淀颗粒继续增加，水溶性钙和总钙含量显著提高，发芽72h时分别为对照的16.77和2.39倍，同时降低了游离和结合态多胺含量，增加了束缚态多胺含量，提高了GA3、LAA、ABA和CTK含量以及H2O2含量，使植酸酶和酸性磷酸酶活力分别提高74.80％和41.98％，植酸含量较对照降低62.27％，提高了无机磷和低级肌醇磷酸含量。此作用效果显著好于单独Spd和CaCl2处理(结果1、结果2)。可见，Spd联合CaCl2处理可通过促进多胺和Ca2+的吸收和转运及多胺降解，促进植酸降解，提高能量代谢，促进胚轴细胞伸长和绿豆芽菜生长。Spd联合CaCl2处理对促进植酸降解具有协同效应。
5、研究了Spd和Ca2+在绿豆芽菜植酸降解中的相互作用。单独用DCHA处理诱导许多钙沉淀集聚在细胞外，添加6mM CaCl2后细胞外钙沉淀增加，发芽72h时水溶性钙和总钙含量分别为对照的15.54和2.15倍，促进了游离态多胺向束缚态转化，提高了激素和H2O2含量，诱导了刚尸和ALP表达，使植酸酶和酸性磷酸酶活力分别较对照提高29.80％和31.69％，植酸含量降低29.25％，逆转了DCHA对植酸降解的抑制作用，促进了细胞的伸长生长。在添加DCHA和CaCl2的基础上，再添加Spd对植酸降解影响不显著。外源Spd可以逆转LaCl3对Ca2+内流的抑制作用，Spd+La处理下芽菜细胞中无肉眼可见钙沉淀，水溶性钙含量与对照无显著差异，但游离态、结合态和束缚态多胺大量积累，其中三种形态Spd在发芽72h时分别较对照提高389.70％、281.37％和289.85％，H2O2含量显著降低，多胺降解受抑，导致GA3、ABA和CTK含量降低，植酸含量较对照提高19.35％，胚轴细胞长度明显小于对照，不能逆转LaCl3对植酸降解和芽菜生长的抑制作用。可见，在绿豆芽菜植酸降解过程中，Ca2+在Spd下游发挥作用。
6、经CaCl2、Spd和CaCl2-Spd处理的绿豆芽菜通过代谢组学分析，在pos和neg扫描模式下分别鉴定出102和87种差异代谢物，这些代谢物主要涉及氨基酸合成与代谢、酚类物质合成、萜类物质合成与降解、脂肪酸代谢、ABC转运体、叶酸合成、糖代谢、磷脂酰肌醇信号系统、激素合成、吲哚生物碱合成、核苷酸代谢及泛醌和其他萜类醌合成，含量显著降低的代谢物主要涉及糖代谢、氨基酸合成和降解途径、酚类物质合成、亚油酸代谢、嘌呤代谢及ABC转运体，含量显著增加的代谢物主要涉及激素合成途径、氨基酸代谢途径、亚麻酸代谢、吲哚生物碱合成及萜类物质的合成与降解途径。其中CE+与Spd共同增强的植酸降解代谢主要源于肌醇磷酸代谢、三羧酸循环和植物激素合成代谢的增强。