论文部分内容阅读
背景&目的结直肠癌是一种常见的全球多发的死亡率高的恶性肿瘤,结直肠癌患者死亡率高的主要原因是难以控制的复发和转移。该肿瘤的发病率呈逐年增加的趋势,其高致残率及致死率给政府带来沉重的医疗和经济负担,而生物学标志物的鉴定有望辅助预测高复发风险的人群,从而实现早期诊断和进一步治疗。新合成的蛋白质在粗面内质网中进行组装合成,进一步运输到高尔基体进行糖基化修饰。上皮组织黏蛋白主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两种,其具有部分共同的结构特征和功能,如细胞黏附、迁移和生长。细胞表面黏蛋白的糖基化在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用,已有研究表明到在结直肠癌的发生和发展过程中常发生糖基化异常。GCNT3基因编码合成C2GnT-2,主要催化折叠蛋白中N-乙酰半乳糖胺残基与丝氨酸/苏氨酸残基连接形成Core 2结构、Core 4结构和I分支。C2GnT-2在正常胰腺、气管、肾脏、胃和肠道的表达随着肿瘤的发生发展而改变。GCNT3在结直肠癌细胞中的潜在作用已被报道,GCNT3在CRC细胞中的过表达抑制了细胞黏附、迁移、侵袭性以及克隆形成能力。通过对119例结直肠癌样本GCNT3 mRNA的定量分析,发现GCNT3基因的低表达是一种有潜力的结肠癌预后生物学标志,可以鉴别早期结肠癌患者高复发风险。在本研究中,我们使用TCGA数据筛选的442例经病理诊断结直肠癌组织来验证GCNT3表达与预后的关系。Ascl2是含有碱性螺旋-环-螺旋的转录因子,是Wnt信号通路的下游靶点,其在肠干细胞和CRC祖细胞中发挥重要作用。结直肠癌中Ascl2过表达影响结直肠癌细胞的生物学行为。然而,Ascl2在CRC细胞中过表达的分子机制尚不清楚。在本研究中,我们报道了CRC细胞中外源Ascl2可通过自调节环激活内源Ascl2表达,包括Ascl2与自身启动子结合并转录激活Ascl2基因的表达。方法1、结直肠癌患者GCNT3表达水平与预后的关系及其对细胞增殖能力的影响。1.1从肿瘤基因组图谱数据库(TCGA)筛选获得442例患者GCNT3表达数据及临床资料。运用X-tile软件的Kaplan-Meier法求出最佳cut-off值,把总样本分为高表达组和低表达组;Cox回归分析用于评价GCNT3表达水平的预后意义,并确定曲线比较的统计学意义;应用卡方检验分析GCNT3表达水平与患者临床特征的关系。1.2采用MTT法检测GCNT3对结直肠癌细胞增殖能力的影响,shRNA-GCNT3/HT-29和shRNA-Ctr/HT-29细胞由本实验室构建保存。2、Ascl2基因自转录调节机制研究2.1使用Western blot和Real-time-PCR检测外源性Ascl2是否能激活内源性Ascl2表达,通过双荧光素酶检测和ChIP检测;2.2使用双荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀技术,验证Ascl2是否与自身启动子结合,并进一步通过自身的转录调控,即自动调控激活。结果1.结直肠癌患者GCNT3表达水平与预后的关系及其对细胞增殖能力的影响。结果显示结直肠癌组织中GCNT3的表达显著低于正常癌旁组织;GCNT3高表达组患者的无病生存率显著高于GCNT3低表达组;在接种后3~4天,shRNA-GCNT3/HT-29细胞的增殖能力显著高于对照细胞。2.Ascl2基因自转录调节机制研究外源性Ascl2可直接激活内源性Ascl2的表达,包括Ascl2与自身启动子结合并转录激活Ascl2的表达。结论1.GCNT3基因在结直肠癌中低表达,其可能是结直肠癌患者无病生存率的独立保护因素。2.结肠癌细胞中的Ascl2转录可以被Ascl2自身激活,包括与自身启动子结合并启动转录。