舍格伦综合征(SS)是一种自体免疫性疾病,该疾病在更年期女性中发病率较高。主要表现为大量淋巴细胞侵袭破坏外分泌腺,导致腺体分泌量减少进而引发患者口腔干燥,唾液稀薄等临床症状。在口腔修复医学中,全口义齿在口内的固位力与唾液的质和量有着重要的关系。舍格伦综合征患者唾液少而粘稠、且呈现口腔干燥的状态,不但使义齿固位困难,而且失去唾液的润滑,义齿易刺激黏膜引起不适和疼痛,严重影响患者的日常生活质量。大量研究表明水通道蛋白5(AQP5)表达异常与SS的发病存在关联性,其表达含量下降是SS患者涎腺唾液分泌异常的重要影响因素,现如今AQP5已成为研究SS疾病的新的靶向基因。但是市面上销售的AQP5抗体灵敏性不高,对实验的研究造成了障碍,故制备出高纯度高特异性的抗体成为实验的关键步骤。由于舍格伦综合征发病机制尚不清楚,现阶段尚无有效的治疗药物,课题组利用AQP5特异性启动子对多种中药进行筛选,为治疗药物的研发提供了新方向。此外,目前常用的SS动物模型多以免疫诱导为主,未能全面的的反映SS环境因素和病理反应,特别是容易忽略雌激素的减少对SS的影响。故本实验以免疫诱导联合雌激素剥夺的方法建立反映舍格伦综合征临床表现的SS动物模型,对研究SS的治疗药物具有重要意义。为制备灵敏度高特异性强的抗体,我们利用AQP5胞外域制备AQP5抗体,采用PCR扩增出AOP5基因183-205位氨基酸片段,将其与表达谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白的质粒pGEX-4T-1进行重组连接,酶切鉴定后获得重组质粒,将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后获得GST-AQP5融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备AQP5多克隆抗体,用间接ELISA法检测AQP5抗体效价。实验结果证明我们成功制备了 AQP5多克隆抗体,为免疫组织化学染色法和western blot检测方法提供了必要工具。中草药是我国传统医学的瑰宝,其天然成分有许多潜在的应用价值。课题组利用荧光素酶报告基因系统筛选200余种中草药,发现人参和西洋参可激活AQP5启动子的转录活性。为进一步研究中草药对舍格伦综合征的治疗作用,本实验利用不同浓度的西洋参、人参及两者的主要活性物人参皂苷Rb1刺激AQP5启动子细胞模型,以荧光素酶报告基因检测方法检测AQP5启动子活性,寻找可显著激活AQP5转录活性的药物浓度。实验结果表明,Rb1、西洋参、人参均能激活AQP5启动子,激活作用呈剂量依赖性,且Rb1的激活作用更明显。之后,我们用Rb1、西洋参、人参刺激人唾液腺润管细胞(HSG),利用western blot检测药物对AQP5蛋白表达的影响,进一步确认药物对AQP5表达活性的调控。结果表明,Rb1能显著上调AQP5蛋白的表达水平。在细胞水平上证实人参属药物上调AQP5蛋白表达的基础上,我们利用免疫诱导联合雌激素剥夺方法构建的SS动物模型,研究Rb1、西洋参、人参等药物的体内效应。首先,以弗氏完全佐剂乳化的小鼠颌下腺匀浆注射于卵巢摘除小鼠体内,再以百日咳联合疫苗加强免疫,成功构建舍格伦综合征小鼠模型。之后,以Rb1、西洋参、人参及雌二醇干预SS小鼠模型,研究药物在小鼠体内的作用机制。给药8周后,观察并记录小鼠体重、唾液量、饮水量的改变。结果发现,与正常组相比,模型组小鼠唾液分泌明显减少,饮水量增多,颌下腺炎性肿大,口干的临床症状较为显著。HE染色病理切片显示,模型组小鼠颌下腺内有大量的淋巴细胞浸润,形成岛状结构。免疫组织化学染色显示,SS模型组小鼠AQP5定位表达量显著低于正常组小鼠,说明颌下腺AQP5表达的减少是SS模型鼠唾液分泌减少的关键原因。与模型组相比,Rb1、西洋参、人参等药物干预小鼠唾液分泌量增多,饮水量减少,颌下腺内淋巴细胞较少,炎性浸润得到改善,其中Rb1纠正口干症状优于其他药物组。特别是Rb1、西洋参、人参各药物组的颌下腺AQP5表达水平有不同程度的恢复,以Rb1对AQP5蛋白表达的促进作用更明显,更贴近正常组。这些结果证明,西洋参、人参,特别是Rb1提高了 SS小鼠颌下腺AQP5的表达水平,缓解SS小鼠的口干症状。相关研究表明西洋参、人参等药物与甾体类激素有相似作用,甾体类激素需要与胞内受体特异性结合才能够发挥其生物学效应。本实验利用免疫组织化学染色的方法,检测不同药物组小鼠颌下腺中ERα、ERβ、AR、GR四种激素受体蛋白定位表达,力求寻找出Rb1等药物调控AQP5表达的受体通路。实验结果表明,与正常小鼠比较,模型组小鼠颌下腺ERα、ERβ表达降低,AR、GR无明显改变。与模型组比较,Rb1药物组小鼠颌下腺中ERα、ERβ受体高表达,而对AR、GR受体的调控作用不明显。在本项研究中,通过药物筛选,我们发现Rb1、西洋参、人参等中药组分激活AQP5启动子报告基因活性,并增强HSG细胞中AQP5的表达。在动物模型上,我们进一步验证了 Rb1、西洋参、人参等中药对颌下腺组织AQP5的调节作用,发现三种药物、特别是Rb1上调了小鼠颌下腺中AQP5的表达水平,上调ERα、ERβ表达,促进腺体分泌唾液,减少饮水摄入,缓解腺体炎性症状。我们的研究发现了 Rb1等药物可能通过ERα、ERβ通路上调颌下腺AQP5的表达,显著缓解和治疗了 SS鼠的口干症状,为SS的药物研发提供了新思路,并展示了广阔的应用前景。