甲壳质，又名几丁质，是自然界最丰富的生物资源之一，具有多种生理功能，广泛应用于各种行业中。但是，几丁质不溶于水限制了它的应用，往往需要对它进行一些化学修饰或部分降解以增加其溶解性。几丁质部分脱乙酰化产物是壳聚糖，它们的降解产物为几丁寡糖、壳寡糖，具有较好的水溶性，易于分散吸收。众多学者研究发现几丁质、壳聚糖及几丁寡糖、壳寡糖具有免疫调节作用。将这些多糖、寡糖经腹腔或静脉给予小鼠，可以使其腹腔渗出液及外周血中多型核白细胞增多，巨噬细胞、脾脏T淋巴细胞、NK细胞等活性增强。各种免疫功能细胞激活后，分泌各种免疫活性分子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子及干扰素等。通过这些分子介导免疫功能细胞互相调节，增强免疫细胞的活性，巨噬细胞释放过氧化氢、一氧化氮等活性物质，T细胞、NK细胞的细胞毒活性增高，整体免疫系统功能增强。几丁质及其衍生物通过调节机体免疫系统功能，能增强机体对多种病原微生物的抵抗作用，对实验性小鼠Meth A纤维肉瘤、S180肿瘤、MM44实体瘤及Lewis肺癌等肿瘤细胞的生长具有抑制作用。 研究表明壳寡糖具有免疫调节作用，有抗感染及抗肿瘤活性。但众多研究以动物整体实验为主，关于壳寡糖对免疫系统某一特定环节直接作用的研究较少。为了探索壳寡糖对免疫系统调节作用的机理，本课题以小鼠巨噬细胞作为研究对象，通过体外实验将壳寡糖作用于巨噬细胞，并在壳寡糖作用前加入IFN-γ对巨噬细胞进行预刺激，运用相对定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)技术，检测壳寡糖对巨噬细胞 浙江大学硕士学位论文 ILl、TNF—a基因转录水平和翻译水平的影响。 首先确定壳寡糖对巨噬细胞作用的最适时间和最适浓度：通过RT干CR 确定最适作用时间为 18h，同样的方法先确定壳寡糖作用浓度范围为 5～50 n g加＊在此范围内进一步实验发现 10～60 n g／ml的壳寡糖能增强巨噬细胞 IL－lP和 TNF－a基因转录，效应有剂量依赖性。选定 40 n g加l浓度的壳寡 糖继续作用于巨噬细胞， 然后确定IFN－Y预刺激的最适时间和最适浓度，实验组加入IFN－Y预 刺激后再加壳寡糖，对照组仅加壳寡糖，继续培养 18h，通过 RT干CR确定 IFN－Y最适预刺激时间为 4h，最适预刺激浓度为 100U／ml。此外，由于 IFN－Y 单独作用也可促进两种细胞因子基因表达，故在巨噬细胞中加入IFN－Y单独 作用 22h，再经阿一PCR检测，发现加 IFN－Y的实验组细胞的几一lp和 TNF－ a基因转录水平与空白对照组相比较无显著性差异，可见，壳寡糖和IFN－v 对巨噬细胞 IL－lp和 TNF一口基因转录水平的影响在作用时间上无一致性，在 壳寡糖作用最适时间时，仅受 IFN－Y刺激的巨噬细胞 IL－lp和 TNF－Q基因 转录己下降至刺激前水平，因此可以认为，IFN－Y的加入仅起到对巨噬细胞 预刺激使之处于敏感状态的作用，有利于增强壳寡糖对巨噬细胞的作用。 在确定了壳寡糖和IFN－Y的最适作用时间及最适作用浓度之后，选取三 组细胞状态良好，数目比较一致的巨噬细胞，实验组中加入 100U／ml IFN－v 预刺激 4h后，再加入 40 u g／ml壳寡糖，加糖对照组则只加 40 n g砌l壳寡糖， 空白对照组两者都不加，继续培养18h。收集实验组和对照组上清培养液留 待ELISA实验用，巨噬细胞通过异硫氰酸脱一酚一氯仿一步法提取总RNA。 RT－PCR结果表明两种细胞因子基因转录水平明显提高，加糖对照组 IL一互 p和 TNF－a基因转录水平分别为空白对照组的 2．l倍和 1．9倍…＜0．of人 实验组 IL－lp和 TNF－a基因转录水平分别为空白对照组的 3．7倍和 4．3倍b ＜0．01）。 ELISA实验结果显示，两种细胞因子分泌也显著增多，加糖对照组IL－l p和 TNF－a分泌量分别为空白对照组的 2．4倍和 2倍b＜0．of人实验组几 刀 p和 TNF－a分泌量分别为空白对照组的 4．2倍和 2．9倍（p＜0．01）。 本实验表明，壳寡糖可以增强小鼠巨噬细胞IL－lp及TNF一口的基因表 ．3． 浙江大学硕士学位论文达，使两种细胞因子基因转录及翻译水平增高，且此促基因表达作用在巨噬细胞经IFN－Y预刺激后显著增强。