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目的:生发基质-脑室内出血(Germinal matrix-intraventricular hemorrhage,GM-IVH)通常由于早产儿自身生发基质脉管系统的脆弱特点,再加上血流动力学及呼吸不稳定等原因,容易造成不成熟血管破裂出血,是早产儿最常见的并发症之一。出血后的血肿压迫了周围脑白质,引发颅高压、离子超载、氧自由基增多,产生一系列如炎症、脱髓鞘,细胞凋亡等病理改变,可使患儿遗留不同程度的神经系统后遗症,造成家庭及社会沉重的经济负担与心理压力。研究发现,早产儿脑白质受损后可见大量透明质酸(Hyaluronic acid,HA)聚集。在研究脱髓鞘损伤的动物实验中发现:HA可以阻碍少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)发育成熟和脑白质髓鞘形成。目前已知,GM-IVH可诱导脑室周围白质产生炎症反应和HA聚集,我们推测HA也可能参与GM-IVH后OPCs发育受阻,阻碍脑白质髓鞘形成。透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)可以分解HA,对发生GM-IVH的早产儿,应用脑内注射HAase降解HA,能否达到减轻HA对脑组织OPCs发育的阻碍作用,继而减轻患者脑白质髓鞘形成障碍?关于这方面的研究国内外少有报道。本实验通过早产兔获取GM-IVH动物模型,给予GM-IVH的动物脑内注射HAase,作为HAase治疗组,并设置对照组,即模型组。观测两个不同指标:(1)神经胶质抗原2(Neuron-glial antigen2,NG2),该指标反应OPCs的发育成熟情况;(2)髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP):反应CNS髓鞘脱失的特异性指标。该实验目的是观察HAase治疗能否改善GM-IVH早产兔脑组织OPC发育受阻,减轻脑室周围脑白质的髓鞘脱失,达到神经保护作用,为临床治疗早产儿GM-IVH提供新思路。方法:1.制备早产兔GM-IVH动物模型:新西兰兔的正常怀孕时间为32天,选择健康孕29天的新西兰大白兔剖宫产,出生的兔子为早产兔。实验共用早产兔80只,体重在30~55g之间,生后给予暖箱保温、早产儿奶粉喂养,将获取的早产兔随机分成正常组、模型组(单纯GM-IVH模型)、治疗组(GM-IVH模型+HAase治疗)三个组别。在生后3小时内,出血组(即模型组和治疗组)的早产兔接受50%的丙三醇注射,注射方式为腹腔注射,剂量为10ml/Kg,目的为诱导早产兔发生GM-IVH。正常组不给予任何处理。所有动物实验操作流程均遵循国际动物委员会制订的伦理道德规范执行。2.出血的确立及治疗:(1)1天后所有早产兔接受头颅超声检查,验证早产兔颅内出血的发生请况。(2)治疗组早产兔侧脑室注射HAase:在超声指引下,在生后第2天、4天和第6天,治疗组早产兔接受经前囟侧脑室注射HAase,剂量为20ul/kg。(3)模型组按上述方法向侧脑室注射同等剂量的生理盐水,正常组不给予任何处理。3.提取脑组织:将正常组、模型组、HAase治疗组三组早产兔分别在生后第3天、7天、14天随机处死,迅速取出脑组织,获得的脑组织一部分放入-80℃冰箱中保存,供蛋白印迹实验使用。其余脑组织置于4%多聚甲醛中固定,进行免疫组化染色和苏木精-伊红染色。4.应用免疫组化法观察三组标本中不同时间点NG2的表达情况。5.应用蛋白印迹实验对比三组标本中不同时间点MBP的表达情况。6.数据分析:应用SPSS19.0统计学软件、Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理,数据符合计量资料时用均数±标准差表示,组间比较采用LSD检验;若数据不满足方差齐性检验则采用秩和检验(rank-sum test)的方法。检验标准设为0.05,P值<0.05有统计学意义。结果:1成功复制GM-IVH动物模型颅脑超声检查结果:模型组30只,未出血有5只,实验期间死亡4只,实际参与实验有21只;治疗组29只,未出血3只,实验期间死亡5只,实际参与实验有21只;正常组21只均未出血,实验期间未发生死亡,实际参与实验有21只。脑组织HE染色结果:诱导GM-IVH成功的早产兔,在光学显微镜下观察脑组织可见:脑室周围大量红细胞及炎性细胞浸润,未出血组无明显变化,证实早产兔GM-IVH模型制备成功。2早产兔脑组织NG2表达本实验发现各组早产兔在脑室周围脑白质区均可见NG2细胞表达。随着时间推移,正常组早产兔脑组织中NG2表达量逐渐降低,三个时间点两两比较,在生后3天与生后7天、生后14天比较,差异具有统计学意义(P<0.05),生后7天与生后14天比较,差异无统计学意义(P>0.05);模型组和HAase治疗组的早产兔脑组织中NG2表达量逐渐降低,三个时间点两两比较,差异具有统计学意义(P<0.05);同一时间点比较,在生后3天与生后14天,NG2细胞表达量:HAase治疗组>正常组>模型组,生后7天NG2细胞表达量略有不同,由大到小依次排序为HAase治疗组>模型组>正常组,无论在生后3天、7天还是14天,任何一个时间段三组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3早产兔脑组织MBP表达各组新生早产兔在脑出血周围脑白质区均可见MBP阳性表达。三组早产兔MBP蛋白的表达量随着日龄的增加而增加,方差分析具有统计学意义(P<0.05)。正常组和HAase治疗组MBP的的表达量在生后3天、7天、14天三个时间点两两比较,差异具有明显统计学意义(P<0.05);在生后14天时,HAase治疗组MBP的的表达量高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组早产兔MBP的表达量在生后14天与生后3天、7天比较,差异具有统计学意义(P<0.05),但生后3天与生后7天比较,两组差异无统计学意义(P>0.05)。在同一时间点,MBP的的表达量为HAase治疗组>模型组,方差分析有统计学意义(P<0.05)。结论:早产兔GM-IVH后,脑组织中NG2、MBP表达量降低,提示GM-IVH阻碍OPCs发育和脑白质髓鞘形成;经侧脑室给予注射透明质酸酶后,HAase治疗组NG2、MBP表达量高于模型组,提示经透明质酸酶治疗后有利于少突胶质前体细胞发育和髓鞘形成。