论文部分内容阅读
第一部分山西省1201例遗传性非综合征型耳聋基因GJB2、GJB3、SLC26A4及mt DNA12S r RNA突变筛查研究目的:耳聋是最常见的感觉神经缺陷性疾病之一,其中约半数以上与遗传因素相关,具有较高的遗传异质性,新生儿中发病率大约1/1000。约70%的耳聋患者为非综合征型。研究表明,GJB2、GJB3、SLC26A4、mt DNA是国内遗传性耳聋的主要致病基因。因此,耳聋有关分子诊断主要是针对以上4个基因的常见突变位点分析。目前,系统性的大规模耳聋相关基因突变检测在我国大多数地区还未进行。本研究通过检测耳聋基因,在山西地区进行非综合征型耳聋患者的分子病因学筛查,了解该地区NSHL基因高频突变,完善该地区耳聋突变数据库,为耳聋的早期诊断治疗及产前筛查提供依据。同时,为地域性耳聋基因诊断试剂盒的研发奠定基础。方法:由山医大二院和太原市中心医院联合收集山西省各地市特殊教育学校的耳聋患者1685例,按照纳入排除标准筛选得到1201例NSHL患者。经患者或者监护人签署知情同意书后采集外周全血,采用EDTA-K2抗凝,-20℃保存。对收集血样进行外周血DNA提取,利用聚合酶链式反应(PCR)技术及Sanger技术进行耳聋常见基因突变分析,统计各个突变位点的频率,最后使用统计学软件进行分析,完成耳聋主要基因突变检出率比较,筛选该地区NSHL热点突变谱。结果:纳入排除标准选出的1201例NSHL患者,均为汉族人群。其中,男性为698例,女性503例,男女比为1.387:1。利用聚合酶链式反应(PCR)技术及Sanger测序技术进行耳聋常见基因突变分析,发现基因突变携带率为31.97%(384/1201)。1.1201例患者中,未检测到GJB3基因发生突变。2.1201例患者中,共发现255例GJB2基因发生突变,携带率为21.23%。其中,c.235del C、c.176-191del16、c.299-300del AT、c.109G>A和c.35del G是热点突变。c.235del C检出率最高,为10.99%(132/1201)。其次为c.299-300del AT,为2.67%(32/1201)。共有203例发生单一等位基因突变,52例携带两个等位基因突变。同时,11个新的突变位点被发现。3.所有非综合征型耳聋患者中,共112例发生SLC26A4热点致聋区域基因突变,携带率为9.33%(112/1201)。其中,IVS7-2 A>G为SLC26A4基因的高频位点,检出率为4.74%(57/1201)。同时发现,5例患者携带IVS7-2 A>G和c.2168 A>G复合杂合位点。4.研究中发现,17例患者携带mt DNA基因突变。其中,15例携带12S r RNA1555A>G,2例携带12S r RNA 1494 C>T。结论:利用聚合酶链式反应(PCR)技术及Sanger测序技术进行耳聋常见基因突变分析,具有比较高的检出率。总体检出率与国内其他地区相似,但不同位点检出率存在较大差别,具有明显地域性。研究发现山西地区耳聋的主要致病基因为GJB2、SLC26A4、mt DNA。c.235del C、c.299-300del AT、c.176-191del16和c.109G>A突变是GJB2的热点突变,IVS7-2A>G和c.2168A>G是SLC26A4基因热点突变,1555A>G突变是mt DNA12S r RNA基因的热点突变位点。其中,最为常见的耳聋突变为c.235del C和IVS7-2A>G。第二部分全外显子测序分析Usher综合症家系基因突变研究目的:Usher综合症是临床上最常见的感音性神经性耳聋,同时合并视网膜色素变性的一种综合征型耳聋疾病,病史及症状成为临床诊断的主要手段。由于其临床表型不具有特异性,基因诊断成为快速、准确的诊断方法。目前,已经发现16个Usher综合症致病基因。本研究中,使用WES对所收集的Usher综合症家系进行致病基因检测,以期发现Usher综合症新的基因突变位点。同时,建立全外显子测序技术用于临床较多致病基因参与遗传病的诊断思路,提高相关疾病的诊断灵敏性和特异性,以及缩短诊断时间。方法:在第一部分中收集的耳聋患者标本1685例中,依据临床特征筛选发现一例疑似Usher综合征型耳聋。询问家族史后,由患者或者监护人签署知情同意书并采集外周全血,采用EDTA-K2抗凝,置于-20℃保存,用于后续DNA提取。同时,选取300例健康对照者。采用全外显子测序技术对患者DNA进行基因分析,利用1000G数据库、db SNP42数据库、noflag SNP138数据库、gwas Catalog数据库及OMIM数据库进行比对分析,筛选出可疑突变位点。对家系内8名采集血液的成员以及健康对照组进行一代测序验证,于HGMD以及Pubmed中对结果进行检索分析。结果:该家系Usher综合症呈现常染色体隐性遗传的特点,家系内共有2名患者,但1名已故。采用全外显子测序后,经过1000G等数据库筛选后,发现7个候选突变位点。在收集血液的家系成员以及健康对照组中使用一代测序进行检测,发现仅有USH2A的c.G373A(p.A125T)与Usher综合症发生基因共分离现象。在HGMD数据库和Pubmed数据库中进行检索发现,该变异已被报道。结论:1.本研究报道了一个包含21名健康人,2名患者(1名已故)的Usher综合症家系。2.研究发现,该家系的致病位点为c.G373A(p.A125T)。3.全外显子测序技术用于Usher综合症的临床基因诊断,提高了疾病的诊断灵敏性和特异性,同时缩短了诊断时间。