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无乳链球菌是导致奶牛乳房炎发生与传染的主要致病菌之一，对牛奶的产量、质量和生产成本都产生严重的不利影响，因此，建立快速灵敏的无乳链球菌检测方法对于保障奶牛养殖业健康发展意义重大。 本论文对无乳链球菌表面蛋白进行了提取和鉴定，在此基础上通过对免疫分析方法工作条件的优化，建立了一种简便、快捷、实用的、以表面蛋白为检测靶标的无乳链球菌双抗夹心ELISA方法。利用变溶菌素对无乳链球菌表面蛋白进行了提取，并利用双向电泳、免疫印迹和质谱分析，对无乳链球菌的表面蛋白进行了分析，结果显示，无乳链球菌ATCC BAA-1138(Ia)上存在着丰富的表面蛋白，其中既包括已经鉴定的表面蛋白，也包含未鉴定的表面蛋白。成功检测到了17种表面蛋白。此外，本研究利用重组技术大量制备和纯化了无乳链球菌的3种表面蛋白，并免疫新西兰白兔和白拉克母鸡制备了多克隆抗体，三种蛋白兔抗的最高效价分别达到48000、36000和36000，鸡抗的最高效价分别达到24000、18000、16000。利用Alpha和Rib表面蛋白多抗作为捕获抗体、Sip表面蛋白多抗作为检测抗体，优化并建立了无乳链球菌的双抗夹心ELISA检测方法，通过优化确定了最佳的检测条件:捕获抗体的包被量为0.5μg/孔;选择0.05M PBS(pH8.0)为包被缓冲液，包被条件为37℃条件下预包被3h后放4℃过夜;封闭液为1％明胶，封闭条件为37℃封闭1.0h;检测抗体的稀释倍数为1∶1000，最佳孵育时间60分钟，酶标二抗的作用时间40分钟。最佳检测条件下，所建立检测方法的灵敏度为1.98×105 CFU/mL。 利用其它导致奶牛乳房炎的细菌停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进行特异性检测，所有菌株在检测浓度下的P/N均小于2，表示没有显著的交叉反应。 与无乳链球菌传统常规培养检测方法相比，本研究所建立的双抗夹心ELISA方法简便快速，并且具有较好的灵敏度和特异性。本研究的开展为无乳链球菌的快速鉴定提供了一种有效的方法，对于奶牛乳腺炎的病原诊断与针对性治疗具有重要的现实意义。