肿瘤细胞的过度增殖或凋亡不足在肿瘤病理机制中起到重要的作用。转录因子Elk1属于ETS原癌基因家族成员之一,是原癌基因c-fos的调节因子,其磷酸化与原癌基因c-fos的转录激活密切相关,与细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生发展相关,可能是恶性肿瘤发生发展的重要环节及细胞侵袭转移的调控通路。外界各种刺激经MAPK信号通路磷酸化Elk1,引起Elk1构象改变,从而增强其DNA结合活性,激活转录活性,上调生长分化相关基因,抑制凋亡相关基因,因而已成为肿瘤基因治疗中的一个新靶点。因此,探讨其相关调控机制,将有助于临床应用中医药对肿瘤的基因治疗。中医药在治疗肿瘤上有其特殊优势。单味中药和中药复方具有多种有效成分,奠定了中药多靶点、多环节、多部位效应的物质基础。因此,在中医理论指导下,结合分子生物学现代技术,深入研究恶性肿瘤中医药多靶点联合治疗的机制,将有希望成为肿瘤治疗和抗复发、转移的重要手段。本研究通过建立与细胞增殖调控关系最为密切的Elk1信号转导通路筛选平台,筛选目前临床上已经使用的四种抗肿瘤中药注射液(即艾迪注射液、康莱特注射液、华蟾素注射液、榄香烯注射液)对细胞增殖相关的信号转导通路靶分子Elk1的影响,并对筛选的结果用Western Blot实验进行二次验证,并进一步对榄香烯注射液抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用和分子机理进行探讨。1目的建立与细胞增殖相关的Elk1信号转导通路筛选平台;筛选四种抗肿瘤中药注射液(即艾迪注射液、康莱特注射液、华蟾素注射液、榄香烯注射液)对细胞增殖相关的信号转导通路靶分子Elk1的影响;评价榄香烯注射液对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响;探讨榄香烯注射液对肿瘤细胞增殖和凋亡影响的作用机理。2方法2.1以人宫颈癌HeLa细胞为模型,选取与细胞增殖调控关系最为密切的Elk1信号传导通路建立筛选平台。首先通过MTT法检测四种中药注射液对HeLa细胞的抑制作用,确定各自的IC50值;然后应用Elk1双萤光素酶报告系统进行筛选,并对筛选的结果用Western Blot实验进行二次验证,检测四种中药注射液对HeLa细胞磷酸化Elk1及其靶基因c-fos表达的影响。2.2以HeLa和HepG2细胞为模型,采用MTT法测定不同浓度的榄香烯注射液对细胞增殖的抑制作用,并确定IC50值;采用光学显微镜和荧光显微镜观察IC50浓度的榄香烯注射液对细胞形态的影响;采用流式细胞分析术,结合荧光染料FITC-Annexin-V和PI对细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻进行分析,观察IC50浓度的榄香烯注射液诱导肿瘤细胞凋亡的作用;采用流式细胞术,结合荧光染料PI对细胞中的DNA含量进行分析,观察IC50浓度的榄香烯注射液对肿瘤细胞增殖的抑制作用;采用Elk1双荧光素酶反式报告基因的筛选技术和Western Blot等技术,观察IC50浓度的榄香烯注射液对Elk1萤光素酶活性、磷酸化的Elk1及其靶基因c-fos的表达的影响,以及对MAPK通路激酶磷酸化、膜受体通路(Caspase-8)和线粒体通路(Caspase-9)活性的影响。3结果3.1抗肿瘤注射液对信号转导分子Elk1活性的筛选3.1.1成功建立与细胞增殖相关的Elk1信号转导通路筛选平台报告质粒pFA- Elk1编码GAL4dbd和Elk1的融合蛋白,pFR-luc编码萤火虫(Firefly)荧光素酶分子,其启动子区含有GAL4dbd的结合位点GAL4UAS,所以萤火虫荧光素酶活性可以反映细胞内转录因子Elk1的活性(磷酸化形式)。内对照质粒pRL-TK编码海肾(Renilla)荧光素酶分子,由TK启动子调控。实验中使用pcDB空载体作为阴性对照,pcDB-MEK1作为激活Elk1的阳性对照。实验结果显示阳性对照分子的活性与预期相符,验证了实验系统的可靠性。3.1.2四种中药注射液对HeLa细胞增殖的抑制作用艾迪注射液100μL/孔作用24h对HeLa细胞体外增殖有明显的抑制作用,求其IC50值为300.60mg·mL-1。康莱特注射液0.39~100μL/孔作用24h对HeLa细胞体外增殖无明显的抑制作用。华蟾素注射液6.25~100μL/孔作用24h对HeLa细胞体外增殖有一定抑制作用,求其IC50值为51.65mg·mL-1。榄香烯注射液1.56~100μL/孔作用24h对HeLa细胞体外增殖有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,求其IC50值为0.08mg·mL-1。3.1.3四种中药注射液对HeLa细胞Elk1萤光素酶活性的影响IC50浓度的上述四种中药注射液处理24h后,通过Elk1双萤光素酶报告系统检测发现,与对照组比较,榄香烯处理组Elk1活性明显受到抑制,艾迪、华蟾素处理组Elk1活性有一定的下调,而康莱特处理组无抑制作用。3.1.4四种中药注射液对HeLa细胞磷酸化Elk1及其靶基因c-fos表达的影响磷酸化的Elk1及其靶基因c-fos在HeLa细胞中稳定高表达,以IC50浓度的上述四种中药注射液处理24h后,通过Western Blot检测发现,榄香烯处理组磷酸化的Elk1及其靶基因c-fos的表达明显下调,艾迪、华蟾素处理组磷酸化的Elk1有一定程度下调,c-fos的表达明显下调,而康莱特处理组无显著抑制作用。3.2榄香烯注射液对肿瘤细胞增殖和凋亡影响的作用机理研究3.2.1榄香烯注射液对HeLa细胞、HepG2细胞增殖的抑制作用在第一部分的中药注射液筛选中,结果提示榄香烯注射液1.56~100μL/孔作用24h对HeLa细胞体外增殖有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,求其IC50值为0.08mg·mL-1。榄香烯注射液0.39~100μL/孔作用24h对HepG2细胞体外增殖有明显的抑制作用,求其IC50值为0.2mg·mL-1。阳性对照紫杉醇注射液0.39~100μL/孔作用24h对HeLa细胞体外增殖有明显的抑制作用,求其IC50值为0.42mg·mL-1。紫杉醇注射液0.39~100μL/孔作用24h对HepG2细胞体外增殖有明显的抑制作用,求其IC50值为0.9mg·mL-1。3.2.2光学显微镜和荧光显微镜观察HeLa细胞、HepG2细胞经IC50浓度的榄香烯分别作用24h后,经光学显微镜观察出现变小、变圆、皱缩、染色质凝集,并从培养皿脱落等现象,经荧光显微镜观察出现凋亡Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态,Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化,Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体,即死细胞数目增多。这些现象与阳性对照紫杉醇注射液引起的细胞改变相一致,是细胞凋亡的典型特征。而在空对照组细胞状态良好。3.2.3细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻分析IC50浓度的榄香烯和紫杉醇注射液分别作用24h后,均可看到细胞FITC-Annexin-V荧光强度增加,说明细胞质膜的PS已经外翻;同时PI荧光强度也有所增加,提示细胞质膜的完整性受到损坏,说明除了凋亡外还存在其它形式的细胞死亡方式。3.2.4细胞周期分析无论是在HeLa细胞还是HepG2细胞,经IC50浓度的榄香烯和紫杉醇注射液分别作用24h后,与空对照相比,榄香烯注射液能阻滞细胞生长于S期和/或G2M期。阳性对照紫杉醇注射液能阻滞细胞生长于G1S期。3.2.5 Elk1信号通路的筛选与空白对照组相比,IC50浓度的榄香烯及紫杉醇注射液处理24h后可抑制Elk1荧光素酶报告活性;而且在PMA+I的刺激下,Elk1荧光素酶报告活性可被榄香烯及紫杉醇注射液抑制,说明二者均能影响HeLa和HepG2细胞Elk1转录活性。3.2.6 Western Blot检测磷酸化Elk1及其靶基因c-fos的表达以β-actin为内对照,与空对照比较,榄香烯注射液能抑制HeLa和HepG2细胞中磷酸化Elk1的水平以及c-fos的表达,而阳性对照紫杉醇注射液只能抑制HepG2细胞中磷酸化Elk1的水平以及c-fos的表达,对HeLa细胞中磷酸化Elk1的水平以及c-fos的表达无显著影响。3.2.7 MAPK通路激酶磷酸化的Western印迹分析用抗磷酸化ERK抗体和抗非磷酸化ERK抗体检测,与空对照组比较,除阳性对照紫杉醇组能显著抑制HeLa细胞和HepG2细胞中磷酸化ERK的水平以外,榄香烯组磷酸化ERK的水平均无明显差异。用抗磷酸化JNK抗体和抗非磷酸化JNK抗体检测,与空对照组比较,榄香烯及紫杉醇注射液均能显著抑制HeLa细胞和HepG2细胞中磷酸化JNK的水平,磷酸化JNK的比例显著降低。用抗磷酸化p38抗体和抗非磷酸化p38抗体检测,与空对照组比较,除阳性对照紫杉醇组能显著抑制HeLa细胞中磷酸化p38水平以外,其余各组磷酸化p38水平均无明显差异。3.2.8 Western印迹检测榄香烯对caspase活性的影响用抗caspase-8抗体和抗caspase-9抗体检测,与空对照组比较,在HepG2细胞中,榄香烯和紫杉醇组cleaved caspase-8和caspase-9的水平都有显著提高;在HeLa细胞中,榄香烯和紫杉醇组cleaved caspase-8的水平有显著提高,full length caspase-9的比例均明显降低,而cleaved caspase-9的水平无明显差异。4结论4.1成功建立了与细胞增殖相关的Elk1信号转导通路筛选平台。4.2四种中药注射液对肿瘤细胞具有选择性抑制作用,且呈剂量依赖性。榄香烯注射液对Hela细胞体外增殖有明显的抑制作用,艾迪、华蟾素注射液有一定程度的抑制作用,而康莱特注射液无明显抑制作用。4.3榄香烯、艾迪、华蟾素注射液抑制人宫颈癌HeLa细胞生长的可能机制之一是下调了Elk1转录活性、转录因子Elk1的磷酸化水平及其靶基因c-fos的表达。康莱特注射液对Elk1萤光素酶活性、磷酸化的Elk1及其靶基因c-fos的表达无显著抑制作用,提示是否还有其它的作用机制尚须进一步探讨。4.4榄香烯注射液能显著抑制HeLa和HepG2细胞增殖,且呈剂量依赖性,其IC50值分别为0.08mg·mL-1和0.2mg·mL-1;阻滞HeLa细胞于S期,HepG2细胞于S和G2M期;能诱导HeLa细胞出现早期凋亡现象,HepG2细胞出现早期和中晚期凋亡现象。4.5榄香烯注射液通过调控JNK MAPK通路,抑制Elk1转录活性,下调转录因子Elk1的磷酸化水平及其靶基因c-fos的表达,发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用;通过调节膜受体通路(Caspase-8)和/或线粒体通路(Caspase-9),从而发挥促进肿瘤细胞凋亡的生物学功能。综上所述,本研究筛选了中药注射液对细胞增殖相关的信号传导通路靶分子Elk1的影响,发现榄香烯注射液的作用尤为显著。证实了榄香烯抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的功能,其分子机理是通过调控JNK MAPK通路,抑制Elk1转录活性,下调转录因子Elk1的磷酸化水平及其靶基因c-fos的表达,调节膜受体通路(Caspase-8)和/或线粒体通路(Caspase-9),从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的生物学功能。这些工作为研究中药注射液的功能和分子机理的线索,并为临床用药提供参考,对于推动中医药抗肿瘤作用机制的深入研究具有十分重要的意义。