论文部分内容阅读
目的:先天性肾盂输尿管连接处梗阻（Ureter-pelvic junction obstruction,UPJO）是儿童肾积水的常见原因之一,在小儿泌尿外科中多见。沉默信息调节因子1（Silent mating type information regulation 2 homolog1,SIRT1）在肾脏广泛表达,参与肾脏生理和病理的复杂调控作用。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system,UPS）通过降解80%以上的细胞蛋白来调节各种细胞功能,以调控细胞周期、基因转录和翻译、细胞存活和凋亡、细胞代谢和蛋白质质量控制等众多生物过程。SIRT1作为机体内广泛表达的蛋白质之一,也受UPS的调控。本研究通过比较DRF<20%和DRF>40%的单侧盂管交接部梗阻肾积水患儿肾组织mRNA-seq数据之间的差异表达,同时通过mRNA-seq分析RNAi SIRT1及阴性对照大鼠肾小管上皮NRK52E细胞并分析差异表达基因,预测分析SIRT1相互作用蛋白,进行SIRT1相关共表达网络分析UPJO患儿肾脏中SIRT1的表达及其调控的靶点,并通过建立单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）新生大鼠模型（一种广泛用于研究阻塞性肾病的动物模型）,探究泛素蛋白酶系统及SIRT1/FOXO1信号通路对UUO新生大鼠肾损伤的影响,进一步通过建立TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮NRK52E细胞模型研究影响肾损伤的调控机制。研究方法:本研究第一部分:分别收集DRF<20%和DRF>40%的单侧盂管交接部梗阻肾积水患儿肾组织样本进行mRNA-seq,将获得的差异表达基因与SIRT1的互作蛋白进行重叠,随后对获得的差异基因进行GO富集和KEGG通路分析,同时通过mRNA-seq分析RNAi SIRT1及阴性对照大鼠肾小管上皮NRK52E细胞获得差异表达基因,将两组mRNA-seq分析数据进行合并分析;将新生大鼠分为Sham组和UUO组,并通过qRT-PCR、免疫荧光以及Western Blot检测各组新生大鼠中SIRT1及重叠的差异基因mRNA和蛋白表达。本研究第二部分:将新生大鼠分为Sham组、UUO组和SIRT1抑制剂组,观察新生大鼠肾组织大体形态变化,HE染色检测新生大鼠肾组织病理形态变化,Masson染色检测新生大鼠肾组织纤维化,Western Blot检测肾组织纤维化相关蛋白表达水平,TUNEL法检测新生大鼠肾组织凋亡水平,Western Blot检测凋亡相关蛋白表达水平,ELISA法检测肾组织氧化应激因子含量,免疫荧光检测肾组织ROS水平,Western Blot和免疫荧光检测上皮间质转化标志物蛋白表达水平;免疫荧光、Western Blot和qRT-PCR检测SIRT1及其下游基因蛋白和mRNA表达水平;将大鼠肾小管上皮细胞分为Control组、TGF-β1组、TGF-β1+SIRT1抑制剂+si-NC组和TGF-β1+SIRT1抑制剂+siFOXO1组,通过Co-IP检测TGF-β组细胞SIRT1和FOXO1蛋白相互作用,通过Western Blot检测大鼠肾小管上皮细胞纤维化相关蛋白表达水平,流式细胞术检测大鼠肾小管上皮细胞凋亡水平,Western Blot检测大鼠肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白表达水平,ELISA法检测大鼠肾小管上皮细胞氧化应激因子含量,免疫荧光检测大鼠肾小管上皮细胞ROS水平,Western Blot和免疫荧光检测大鼠肾小管上皮细胞上皮间质转化标志物蛋白表达水平。本研究第三部分:将新生大鼠分为Sham组和UUO组,通过Western Blot和免疫组化检测UUO新生大鼠泛素-蛋白酶体系统相关蛋白表达水平,将大鼠肾小管上皮细胞分为Control组、TGF-β1组和TGF-β1+阿霉素组,TGF-β1诱导鼠肾小管上皮细胞,阿霉素激活泛素-蛋白酶体系统,Western Blot检测细胞泛素-蛋白酶体系统相关蛋白、SIRT1和FOXO1蛋白和纤维化相关蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白表达水平,免疫荧光检测细胞ROS水平,ELISA检测细胞氧化应激因子含量,Western Blot和免疫荧光检测细胞EMT相关蛋白表达水平。结果:本研究第一部分:与DRF>40%的单侧盂管交接部梗阻肾积水患儿肾组织相比,DRF<20%的单侧盂管交接部梗阻肾积水患儿肾组织包括SIRT1、ADIPOQ和GSTT1等1427个基因上调,包括FOXO1、PPARGC1A和HLA-DRB5等1099个基因下调,对mRNA-seq的差异表达基因和SIRT1相互作用蛋白进行重叠分析,FOXO1和PPARGC1A可作为UPJO中SIRT1的靶基因,FOXO1的共表达基因主要富集在羧酸代谢、有机酸代谢、单羧酸代谢、羧酸分解等生物学进程中,主要参与代谢通路、脂肪酸降解以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解,PPARGC1A的共表达基因主要富集在蛋白质定位于核仁、p53类介质调节信号转导、单羧酸代谢、羧酸分解等生物进程中,RNAi SIRT1大鼠肾小管上皮NRK52E细胞与阴性对照细胞相比,2382个基因上调,2138个基因下调,且上调的基因主要富集在组织发育、蛋白质代谢调控和泛素化相关蛋白转录活性等生物学进程中,SIRT1 mRNA和蛋白表达上调,FOXO1和PPARGC1A mRNA和蛋白表达下调。本研究第二部分:SIRT1抑制剂逆转了UUO新生大鼠肾组织积水,改善肾组织病理学损伤,降低肾组织纤维化及纤维化相关蛋白α-SMA、Fibronectin和Collgen I表达水平,抑制肾组织细胞凋亡,降低细胞凋亡相关蛋白Bax和cleavedcaspase3表达水平,增加Bcl-2蛋白表达水平,降低肾组织活性氧水平,增加GSH含量,降低MDA含量,增加肾组织EMT标志物E-cadherin蛋白表达水平,降低N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平,降低肾组织SIRT1 mRNA和蛋白表达水平,增加FOXO1和PPARGC1A mRNA和蛋白表达水平;SIRT1与FOXO1蛋白相互作用,且SIRT1抑制剂降低TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞及纤维化相关蛋白α-SMA、Fibronectin和Collgen I表达水平,降低TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡,降低细胞凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase3表达水平,增加Bcl-2蛋白表达水平,降低TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞活性氧水平,增加GSH含量,降低MDA含量,增加TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞EMT标志物Ecadherin蛋白表达水平,降低N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平,沉默FOXO1逆转了SIRT1抑制剂的作用。本研究第三部分:UUO新生大鼠泛素-蛋白酶体系统相关蛋白Nedd4、Smulf1、MURF和Atrogin-1表达水平降低,泛素-蛋白酶体系统激活剂逆转TGF-β1对大鼠肾小管上皮细胞Nedd4、Smulf1、MURF和Atrogin-1蛋白表达的抑制作用,且降低SIRT1 mRNA和蛋白表达,增加FOXO1 mRNA和蛋白表达,降低细胞纤维化相关蛋白α-SMA、Fibronectin和Collgen I表达水平,抑制细胞凋亡,降低细胞凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase 3表达水平,增加Bcl-2蛋白表达水平,降低细胞活性氧水平,增加GSH含量,降低MDA含量,增加细胞EMT标志物E-cadherin蛋白表达水平,降低N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。结论:泛素-蛋白酶体系统介导SIRT1/FOXO1信号通路促进UUO新生大鼠肾组织病理损伤,增加肾组织纤维化、肾小管上皮细胞凋亡、肾组织氧化应激及EMT。