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【目的】本研究拟以绵羊PRNP等位基因高变区扩增片段为研究对象进行PCR-SSCP优化试验,以期建立适合于绵羊PRNP等位基因多态性研究的PCR-SSCP分析方法;用PCR-SSCP技术分析甘肃省永昌羊场104只健康滩寒杂交绵羊(滩羊×小尾寒羊)(♀)PRNP等位基因多态性,以了解和掌握此绵羊群体PRNP 136、154和171位密码子等位基因型频率分布,并依此评估其罹患绵羊痒病的可能性。同时,筛选出用于抗痒病育种的ARR纯合子或ARR杂合子等位基因型绵羊个体,为下一步抗痒病育种计划提供基础种羊。【方法】试剂盒法提取绵羊全血基因组DNA,设计特异性引物扩增绵羊PRNP等位基因目的片段。(1)以此扩增产物为试验材料,就交联度、凝胶浓度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、上样量、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液离子浓度等影响SSCP分析的因素进行优化,建立绵羊PRNP等位基因目的片段PCR-SSCP分析法。(2)进行各扩增产物的琼脂糖凝胶电泳、纯化回收目的片段、连接pMD-18T载体、转化E.coli DH5α,于LB平板(Amp+)上培养后,挑取无色透明菌落,以PCR扩增、双酶切、SSCP法鉴定并筛选出阳性克隆后测序。应用DNA Star软件比对分析测序结果并确定各绵羊PRNP 136、154和171位密码子等位基因型,经数学统计分析不同等位基因型的频率分布,并对此绵羊群体痒病易感性做出评估。【结果】PCR-SSCP优化试验表明,PCR产物与变性缓冲液比例为1﹕4、电泳缓冲液为0.5×TBE、上样量≥2.0μL且<4.0μL、交联度49﹕1、凝胶浓度12%、甘油浓度0%、电泳电压200V、4℃条件下电泳45h为最佳条件优化组合。从104只绵羊中共检出15个PRNP 136、154和171位密码子等位基因型,其中:痒病易感基因型(ARQ/ARQ,n=38;ARQ/ARH,n=11;VRQ/ARQ,n=5;ARH/ARH,n=2)占53.85%(56/104),半抗性基因型(ARR/ARQ,n=12;ARR/ARH,n=1)计12.50%(13/104),抗性基因型(ARR/ARR)为22.12%(23/104),未知与痒病关系的其他基因型(ARK/ARQ,n=4;ARK/ARH,n=2;AHR/ARQ,n=1;TRQ/TRQ,n=1;TRQ/ARR,n=1;TRQ/ARQ,n=1;ARQ/ARP,n=1;ARK/ARK,n=1)共计11.54%(12/104),其中ARQ/ARP为首次发现。另发现18个其他突变位点,其中L141F、R167G、N176Y和Q189L为已发现突变位点,Y131N、L133P、G134R、E149V、M157T、Y158H、N162P、Y166D、F178S/L、C182S、E199V/M/L、N200I、F201S、M209T为新发现的14个突变位点,数目最多的为E189L(33/208)、R167G(9/208)、L141F(8/208),其余突变频率很低(约0.48～1.92%)。【结论】本研究所建立的绵羊PRNP等位基因多态性PCR-SSCP分析法,经分析应用证明是稳定可靠的。在104只健康滩寒杂交绵羊中,PRNP密码子136、154和171的痒病易感基因型ARQ/ARQ、ARQ/ARH、VRQ/ARQ和ARH/ARH占优势(53.85%,56/104),该绵羊群属于痒病易感/易发群体,一旦痒病传入具有罹患痒病的极大可能性。