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急性肾损伤(actue kidney injury,AKI)表现为肾功能急剧下降,是一种由多种病因引起的临床综合征,也是临床常见的急危重症之一。其发病原因主要包括缺血缺氧、脓毒血症、肾毒性药物等,其病理特征包括小管坏死、炎症反应和氧化应激等。全球每年约1300万人发生急性肾损伤,持续损伤或损伤较重时可导致肾脏不完全修复和进展性纤维化,是引起继发性慢性肾脏病、肾衰竭及住院患者死亡的重要原因。迄今为止,除支持治疗之外,AKI尚缺少特异、有效的防治措施,因此,开发减轻组织损伤、促进修复的肾脏保护药物具有重要的临床应用价值。程序性坏死是不同于凋亡的重要细胞死亡类型,在急性肾损伤的发病和进展中扮演着重要角色。程序性坏死发生时,细胞器快速肿胀,早期质膜破坏,细胞内容物泄漏,并因此引发炎症。Necrostatin-1(Nec-1)是一种经典的RIPK1抑制剂,并且在急性肾损伤中具有一定的保护作用。然而由于Nec-1具有药效一般、非理想的药代动力学特性等缺点,尚未能应用于临床中。因此,本研究旨在探索高效、安全的新型RIPK1抑制剂,通过建立经典的TNF-α+z VAD刺激和顺铂刺激的两种体外程序性坏死模型对一系列化合物进筛选。其中化合物Cpd-71表现出理想的细胞保护作用,然而Cpd-71是否具有防治急性肾损伤的潜力及其作用机制尚有待进一步探明。此课题的研究内容主要包括以下四个部分:1.Cpd-71减轻顺铂诱导的急性肾损伤(1)体外实验:以人肾小管上皮细胞(HK2)为实验对象,首先使用MTT实验探究Cpd-71对顺铂介导的细胞损伤的保护作用,实验结果表明,当Cpd-71浓度≤0.4μM时,Cpd-71不具有细胞毒作用。将细胞加顺铂刺激和药物孵育后,通过对比细胞生存率和KIM1表达变化表明Cpd-71浓度为0.1,0.2和0.4μM时,可以显著减轻顺铂诱导的肾小管细胞损伤。(2)体内实验:将C57BL/6J雄性小鼠(约20-22g)随机分为正常对照NC组、模型组(Cisplatin 20 mg/kg)、Cpd-71低剂量组(Cisplatin 20 mg/kg+Cpd-71 0.825mg/kg)、中剂量组(Cisplatin 20 mg/kg+Cpd-71 1.65 mg/kg)、高剂量组(Cisplatin20mg/kg+Cpd-71 3.3 mg/kg)和阳性药Nec-1组(Cisplatin 20 mg/kg+Nec-1 1.65mg/kg),每组6只。不同剂量给药组小鼠在顺铂注射前12h通过腹腔注射进行药物干预,每天1次。模型组和给药组小鼠以20mg/kg的剂量腹腔注射顺铂,正常组注射生理盐水作为对照,建立顺铂诱导的急性肾损伤模型。3天后,在麻醉状态下牺牲小鼠,收集血清和肾组织样本。通过PAS糖原染色检查小鼠的病理学肾脏损伤,肌酐和尿素氮试剂盒检测血清中Cr和BUN水平,实验结果发现Cpd-71可以减轻顺铂介导的肾损伤以及形态学变化,同时肾损伤因子KIM1的Western blot,Real-time PCR和免疫组化结果进一步得到证实。值得注意的是,相同浓度下,Cpd-71比Nec-1具有更好的保护作用。2.Cpd-71减轻顺铂诱导的炎症反应(1)体外实验:通过Real-time PCR技术同样证实了Cpd-71可以降低炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的m RNA水平。(2)体内实验:通过免疫组化以及Real-time PCR技术检测巨噬细胞标记物F4/80+和炎症因子TNF-α,IL-6以及趋化因子MCP-1的表达。实验结果显示,Cpd-71可以减轻顺铂诱导的AKI小鼠的炎症反应;3.Cpd-71降低顺铂诱导的氧化应激水平(1)体外实验:利用DCF荧光染色进行活性氧(ROS)测定,检测Cpd-71对氧化应激的影响。结果显示Cpd-71显著降低顺铂诱导的HK2细胞中ROS水平,同时,使用DHE染色检测超氧化物水平(NOX酶的反应物),结果显示与Nec-1药物组相比,Cpd-71组超氧化物水平进一步降低。Western blot和Real-time PCR结果进一步验证了上述结果。Cpd-71相比于Nec-1能更明显地降低NOX4蛋白和m RNA水平。(2)体内实验:使用GSH和MDA试剂盒,Western blot以及Real-time PCR技术检测小鼠氧化应激水平和NOX4表达。实验结果显示,在模型组中GSH水平显著降低,但经Cpd-71处理后可成剂量依赖性方式恢复,这与Cpd-71抑制顺铂诱导的MDA水平上调的检测结果一致。此外,与模型组相比,Cpd-71给药组明显降低顺铂诱导的NOX4的蛋白和m RNA水平。以上结果表明Cpd-71能有效降低顺铂诱导的AKI小鼠ROS的产生和氧化应激水平,体内自由基过氧化情况得到改善;4.Cpd-71减轻顺铂诱导的细胞程序性坏死(1)体外实验:运用透射电镜、免疫荧光和Western blot技术分别观察细胞结构、检测程序性坏死蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL的表达情况。实验结果发现,模型组细胞核肿胀、细胞器消失,而模型+Cpd-71组则改善了HK2细胞结构的损伤,免疫荧光和Western blot结果显示,Cpd-71下调程序性坏死蛋白RIPK1/RIPK3的表达,抑制MLKL磷酸化,且效果优于Nec-1阳性药对照组。分子对接实验和Co-IP结果显示Cpd-71通过结合RIPK1酶的ATP活性口袋从而抑制RIPK1活性,进而抑制顺铂诱导RIPK1/RIPK3复合物的形成,其提示Cpd-71可能是靶向RIPK1调控的细胞程序性坏死改善顺铂诱导的细胞损伤。(2)体内实验:运用免疫组化、免疫荧光和Western blot技术检测细胞程序性坏死通路关键蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL的表达变化。结果显示Cpd-71抑制RIPK1和RIPK3表达、降低MLKL磷酸化水平,减轻了顺铂诱导的程序性坏死。运用细胞热转变分析(CETSA)实验检测Cpd-71与RIPK1的靶向结合。实验结果发现,可溶性RIPK1蛋白在变性温度范围为47至59℃,相比较正常组,经Cpd-71处理的小鼠显示RIPK1的热稳定性显着提高,这表明Cpd-71可能直接与RIPK1蛋白结合。提示RIPK1可能是Cpd-71防治急性肾损伤的关键靶点;