花生肽-钙螯合物的制备、结构表征及促钙吸收特性研究

来源 :河南工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hangxujie
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钙在人体生长发育过程中起着极其重要的作用,钙摄入不足可能会导致许多疾病。肽钙补充剂作为一种新兴的补钙产品,其吸收率高且安全性好,具有较好的应用前景。花生蛋白是一种优质植物蛋白,主要用于榨油,榨油后的花生粕蛋白含量非常丰富,其酶解产物花生多肽具有金属离子螯合活性,是制备花生肽-钙螯合物的良好基料。本论文以花生粕为研究对象,利用酶解技术获得花生肽,将其与无水氯化钙螯合制备花生肽-钙螯合物。采用多种现代分析手段对花生肽-钙螯合物的结构特性进行分析,探究肽钙结合机制;评价花生肽-钙螯合物的稳定性,并利用Caco-2细胞模型研究其促钙吸收特性,旨在为植物基肽钙制剂的开发奠定理论基础。具体内容及相关结果如下:(1)采用复合酶解技术制备花生肽-钙螯合物。首先通过酶解技术获得花生源钙螯合肽,研究不同的酶解模式及酶解条件对花生肽-钙螯合物螯合率的影响。结果表明,以碱性蛋白酶复配风味蛋白酶制备的花生蛋白酶解产物的钙螯合率最高(58.72%),在此条件下得到最佳花生蛋白酶解物(PPH),并与无水氯化钙螯合制备花生肽-钙螯合物(PPH-Ca)。在单因素试验的基础上采用响应面法对螯合工艺进行优化,得到最佳螯合条件为肽钙质量比7.2:1、螯合pH 7.5、螯合时间50 min、螯合温度47℃,在此条件下螯合率达到75.26%,与预测值75.75%接近。(2)花生源钙螯合肽的分离纯化及结构特性分析。首先采用凝胶过滤色谱(Sephadex G-25)和琼脂糖凝胶阴离子交换色谱(DEAE-Sepharose-FF)对PPH进行分离纯化并对分离组分进行螯合率测定,结果发现F21组分的钙螯合率最佳,为81.37%。其次,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对F21组分进行肽段序列鉴定分析,得到6条纯化的肽段,其分子量均小于<2 kDa,且氨基酸序列中酸性氨基酸和精氨酸出现的频率较高,说明这些氨基酸对花生肽的钙结合能力有促进作用。最后,选用组分F21(PPH21)制备花生肽-钙螯合物(PPH21-Ca),通过光谱技术、Zeta电位、扫描电镜、X射线衍射等多种技术手段对其进行结构特性分析。结果发现,多肽中氨基和羧基均参与了螯合反应,形成了不同于花生肽的新物质;与PPH21相比,PPH21-Ca在表面形貌以及晶体结晶化程度上发生了改变;氨基酸组成分析也表明花生肽中能与钙离子的结合能力的氨基酸主要是肽链上的酸性氨基酸。(3)花生肽-钙螯合物的稳定性研究。通过热重(TG)和差示扫描量热法(DSC)分析PPH21及PPH21-Ca的热稳定性。结果表明,与PPH21相比,PPH21-Ca热稳定性更好,且PPH21-Ca在一定的温度范围(40-90℃)内仍能保持良好的热稳定性;酸碱稳定性结果表明,当pH体系处于中性和弱碱性情况下,PPH21-Ca稳定性良好,处于酸性情况下,稳定性变差;磷酸盐介质中的稳定性结果表明,PPH21-Ca在低浓度的磷酸盐介质中具有更高的稳定性;共存成分稳定性结果表明,乳糖和氯化钠对PPH21-Ca的稳定性没有显著影响,而粗纤维在一定程度上会削弱PPH21-Ca的稳定性。体外模拟消化结果表明,PPH21-Ca在模拟胃液中的稳定性要弱于模拟肠道消化的稳定性,但是其钙保留率则始终保持在80%以上,说明PPH21-Ca对胃蛋白酶、胰蛋白酶具有一定的抗消化能力。(4)花生肽-钙螯合物的促钙吸收特性研究。首先构建Caco-2细胞模型,通过跨膜电阻(TEER)以及碱性磷酸酶(AKP)活性的变化来评价细胞单层膜是否具有完整性。结果表明:当培养15天时,跨膜电阻值大于400Ω/cm~2、AKP活力之比接近5:1,证明此时细胞已经逐渐分化、形成紧密的单层膜,可用于促钙吸收转运实验。经MTT法筛选样品的浓度发现,当PPH21-Ca的浓度为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL,CaCl2的浓度为0.25 mg/mL时,此时样品浓度对细胞的凋亡没有影响(细胞存活率为90%以上)。在此浓度范围内测定PPH21-Ca和CaCl2的钙转运量和生物利用率,发现PPH21-Ca的钙转运量随着浓度的增加不断升高,最高为38.87μg/well,显著高于CaCl2(24.17μg/well),且消化前后的PPH21-Ca的钙转运量无显著变化;PPH21-Ca的生物利用率为58.37%,显著高于无机钙(36.96%)。因此所得到的花生肽-钙螯合物(PPH21-Ca)具有较高的钙利用率,本研究为新型肽钙补充剂的开发提供了重要参考。
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