【摘 要】
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黄曲霉菌(Aspergillus flavus)是一种常见的腐生型好氧真菌,多见于发霉的粮食作物中。黄曲霉菌危害主要分为以下三个方面:a、黄曲霉极易污染粮食作物,不仅损害粮食品质,而且影响经济效益。b、黄曲霉侵染人畜,导致人和动物曲霉病。c、黄曲霉菌产生的次级代谢产物—黄曲霉毒素(afaltoxin)具强毒性和强致癌性。对于黄曲霉的防控,目前有效的措施有物理方法(微波、辐射、光调控等),化学方法(
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黄曲霉菌(Aspergillus flavus)是一种常见的腐生型好氧真菌,多见于发霉的粮食作物中。黄曲霉菌危害主要分为以下三个方面:a、黄曲霉极易污染粮食作物,不仅损害粮食品质,而且影响经济效益。b、黄曲霉侵染人畜,导致人和动物曲霉病。c、黄曲霉菌产生的次级代谢产物—黄曲霉毒素(afaltoxin)具强毒性和强致癌性。对于黄曲霉的防控,目前有效的措施有物理方法(微波、辐射、光调控等),化学方法(氨气熏蒸法、臭氧法、天然产物法等),生物方法(筛选抗黄曲霉的微生物及其代谢产物等)。其中,凭借高效、绿色、安全等优点,天然产物抑菌法受到越来越多的重视。本文主要研究丹皮酚对黄曲霉菌的抑制作用及抑菌机理,主要研究结果如下:(1)丹皮酚对黄曲霉孢子和菌丝的最小抑菌浓度(MIC)均为0.625 mg/m L。通过扫描电子显微镜(SEM)观察可知,MIC处理后,黄曲霉菌丝形态发生改变,菌体褶皱变形,甚至断裂。透射电子显微镜(TEM)显示细胞外壁纤维修饰物减少,细胞内壁变薄,且质壁分离,细胞器溶解,细胞器之间无明显界限,结构混乱。在体外抑菌实验中,MIC组可完全抑制72 h内黄曲霉菌在花生、玉米粒和花生酱上的生长。(2)在0和1/2 MIC丹皮酚处理下,通过RNA测序进行黄曲霉菌丝基因表达谱分析。共得到5247个差异表达基因(DEGs),其中上、下调基因各占2697和2550个。部分DEGs参与了细胞壁多糖(β-1,3-葡聚糖、几丁质)及其相关酶合成、细胞膜组成(如麦角固醇、海藻糖等)、氧化还原系统及黄曲霉毒素的生物合成等。由DEGs中的GO分析结果可知,丹皮酚主要影响了黄曲霉代谢过程和细胞膜、细胞器等细胞成分。由KEGG Pathway结果可知,丹皮酚主要影响了黄曲霉多糖、脂质等的代谢通路以及黄曲霉毒素的生物合成通路。(3)丹皮酚对黄曲霉菌丝细胞壁的影响。傅里叶红外变换光谱(FT-IR)分析发现,丹皮酚改变了细胞壁表面羟基官能团结构。X射线光电子能谱(XPS)表明丹皮酚改变了细胞壁表面C、N、O含量及蛋白质、脂质含量。此外,通过降低β-1,3-葡聚糖合酶活性和增加几丁质酶活性,丹皮酚显著降低β-1,3-葡聚糖和几丁质含量。实时荧光定量PCR(QRT-PCR)结果表明,与对照组相比,1/2 MIC处理下β-1,3-葡聚糖和几丁质合成相关基因表达量下降。(4)丹皮酚对黄曲霉菌丝细胞膜的影响。碘化丙啶(PI)染色实验、细胞内容物释放实验、相对电导率和细胞外p H值及金属离子测定实验表明,丹皮酚破坏了黄曲霉细胞膜的完整性和通透性,导致细胞内核酸、离子等物质的泄露。总脂质、丙二醛、甘油、麦角固醇和海藻糖含量检测实验表明,丹皮酚破坏了黄曲霉菌丝细胞膜成分。活性氧(ROS)、过氧化氢(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)含量和氧化还原相关酶--超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性等指标表明,丹皮酚干扰了黄曲霉氧化还原系统,造成黄曲霉的氧化损伤。上述细胞膜成分(麦角固醇)和氧化还原相关酶(CAT、SOD等)的实验结果在QRT-PCR中同样得到证实。(5)丹皮酚对黄曲霉毒素的抑制作用。在MIC组处理下,96 h内大米培养基上黄曲霉毒素(AFB1和AFB2)的产生几乎受到完全抑制,且这种抑制作用与丹皮酚浓度呈正相关。上述结果与QRT-PCR实验中毒素合成相关基因表达量变化结果一致。结合前面转录组结果可知,通过调节毒素合成通路中基因的表达,丹皮酚可以抑制黄曲霉毒素的产生。
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