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结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病。MTB能侵入人体全身多种器官，其中以肺脏为主，称为肺结核。TB曾经是危害人类的主要杀手之一，夺去了数亿人的生命,同时也有很多患者是由于感染牛型分枝杆菌而患病，他们大多是由于食用未消毒的牛奶或与患病牛接触而得病，这就使结核病广泛流行于人类与牛群之间。控制结核病流行与蔓延的关键在于找到快速、简便、特异性强、灵敏度高的诊断方法。本实验选取并克隆部分结核分枝杆菌基因，构建原核表达载体，将其转入感受态细胞中进行表达，以获得MTB的重组抗原蛋白，检测重组蛋白提高PPD血清学检测的效果，为结核病诊断奠定实验基础。
选取MTB基因Rv2647、Rv0222、Rv3426、Rv1419进行引物设计及PCR扩增。构建重组质粒pET-32a-Rv2647、pET-32a-Rv0222、pET-32a-Rv3426、pET-32a-Rv1419。其中pET-32a-Rv2647、pET-32a-Rv0222、pET-32a-Rv3426的构建方法采用T4连接，pET-32a-Rv1419的构建方法采用近年来引入载体构建的同源重组方法，连接产物克隆到T1感受态，然后提取测序正确的重组质粒，转入Rosetta(DE3)感受态，用1mmol/LIPTG诱导表达并进行SDS-PAGE分析，其中Rv2647、Rv0222、Rv3426蛋白以包涵体形式表达，Rv1419蛋白以可溶形式表达，分子质量依次为36kDa、46kDa、42kDa、34kDa。Westernblot验证为目的蛋白，经Ni-IDA纯化后，获得纯化的目的蛋白。
以PPD为包被抗原，通过双方阵滴定确定了PPD的最适稀释倍数为1∶3200，血清最适稀释倍数为1∶100，酶标抗体的最适稀释倍数为1∶5000，四个抗原蛋白的最适包被浓度为Rv1419∶0.625μg/mL；Rv0222：0.625μg/mL；Rv2647∶1.25μg/mL；Rv3426∶2.5μg/mL。以纯化后的重组蛋白与PPD进行组合检测72份阳性血清和48份阴性血清，评价四个重组蛋白对PPD检测的敏感性、特异性是否有提高。结果显示，Rv0222蛋白对PPD的检测准确性有提高，Rv1419和Rv2647提升效果不明显，Rv3426能够提升PPD的敏感性。
选取MTB基因Rv2647、Rv0222、Rv3426、Rv1419进行引物设计及PCR扩增。构建重组质粒pET-32a-Rv2647、pET-32a-Rv0222、pET-32a-Rv3426、pET-32a-Rv1419。其中pET-32a-Rv2647、pET-32a-Rv0222、pET-32a-Rv3426的构建方法采用T4连接，pET-32a-Rv1419的构建方法采用近年来引入载体构建的同源重组方法，连接产物克隆到T1感受态，然后提取测序正确的重组质粒，转入Rosetta(DE3)感受态，用1mmol/LIPTG诱导表达并进行SDS-PAGE分析，其中Rv2647、Rv0222、Rv3426蛋白以包涵体形式表达，Rv1419蛋白以可溶形式表达，分子质量依次为36kDa、46kDa、42kDa、34kDa。Westernblot验证为目的蛋白，经Ni-IDA纯化后，获得纯化的目的蛋白。
以PPD为包被抗原，通过双方阵滴定确定了PPD的最适稀释倍数为1∶3200，血清最适稀释倍数为1∶100，酶标抗体的最适稀释倍数为1∶5000，四个抗原蛋白的最适包被浓度为Rv1419∶0.625μg/mL；Rv0222：0.625μg/mL；Rv2647∶1.25μg/mL；Rv3426∶2.5μg/mL。以纯化后的重组蛋白与PPD进行组合检测72份阳性血清和48份阴性血清，评价四个重组蛋白对PPD检测的敏感性、特异性是否有提高。结果显示，Rv0222蛋白对PPD的检测准确性有提高，Rv1419和Rv2647提升效果不明显，Rv3426能够提升PPD的敏感性。