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研究目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的恶性肿瘤之一,其中有一小部分结直肠癌是长期的炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）发展而来的。IBD包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。IBD的致病机制仍没有明确。遗传因素、饮食习惯、心理应激反应、固有层细胞的激活、较高的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平、以及肠道菌群失调都会引起IBD。虽然在临床上有一定的治疗手段,但是手术切除受损肠段仍然是IBD患者最主要的治疗方法。NADPH氧化酶作为细胞膜上产生ROS的重要结构,在炎症阶段也起到重要的作用。二苯基氯化碘盐（Diphenyleneiodonium,DPI）作为NADPH氧化酶抑制剂,能够广泛抑制NADPH氧化酶的不同亚型,并且有文献报道DPI在一些炎症性疾病中具有比较好的抑制炎症的作用。但是由于其较大的毒副作用,并不能很好的应用在临床。在我们的研究中,通过改变DPI的剂量和作用时间,在体内和体外实验中探究DPI在CAC的发生和发展过程中的作用、DPI对固有层细胞的影响、DPI对体内和体外ROS水平的影响和相关的作用机制,为CAC和IBD的临床前研究提供了新的研究思路。研究方法:本研究应用小鼠CAC和葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的肠炎模型作为研究对象。首先在DSS诱导的小鼠肠炎模型中,确定合适的DPI应用浓度。通过建立小鼠致死性肠炎模型,观测实验组和对照组小鼠的死亡率差异。在造模和未造模小鼠中,应用以下实验来探索DPI在肠炎中的作用机制:（1）在肠炎模型中评估DPI对小鼠肠炎的治疗效果;（2）H＆E染色,观察和分析实验组和对照组肠壁组织的完整程度;（3）应用PAS糖原染色观察造模和未造模小鼠肠壁中实验组和对照组的黏蛋白水平;（4）通过荧光定量PCR技术检测小鼠肠道固有层中炎症因子水平的改变,以及M1型相关基因的m RNA水平;（5）应用ELISA实验,检测造模和未造模小鼠实验组和对照组的血清中,炎症因子水平的改变,其中包括IL-6和TNF-α;（6）应用免疫组化染色,检测造模和未造模小鼠中,实验组和对照组小鼠肠壁中免疫细胞的含量;（7）在体外培养RAW264.7细胞株和骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow derived macrophage,BMDM）,加入LPS和DPI或者对照溶剂进行刺激,收集细胞培养液上清,提取细胞RNA和蛋白;（8）用ELISA实验检测经过刺激的细胞上清液中,炎性因子水平的改变,其中包括IL-6和TNF-α。为研究DPI是否会影响M2型巨噬细胞的极化,我们做了以下实验:（1）体外培养BMDM,并加入IL-4和DPI或者对照溶剂进行刺激,分别提取细胞的RNA和蛋白进行荧光定量PCR和免疫印迹的检测;（2）检测M2型巨噬细胞的表面标记物,分别是Arg1、YM1和CD206。此外,为了进一步了解DPI在小鼠肠炎中缓解炎症的分子机制,我们又做了以下实验:（1）应用蛋白印迹来了解固有层细胞炎症相关信号通路的激活状态;（2）免疫组化方法检测造模和未造模中,实验组和对照组小鼠肠道中8羟基脱氧鸟苷酸（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-Ohd G）水平;（3）应用LPS在小鼠体内建立急性炎症模型,并应用ELISA实验比较DPI组和对照组小鼠中血清炎症因子水平的改变;（4）建立小鼠的腹膜炎模型,并统计DPI组和对照组小鼠腹腔巨噬细胞的数量:（5）应用流式细胞仪检测小鼠腹腔中CD45阳性的细胞中,巨噬细胞的标记物F4/80和CD11b双阳性的百分比。为了更进一步探究DPI在CAC中的作用,我们做了一下实验:（1）氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）和致炎剂DSS建立小鼠CAC模型;（2）在建立模型的早期腹腔注射DPI,观察肠道内肿瘤的数量、大小和小鼠肿瘤负荷的变化;（3）在造模小鼠中提取DPI组和对照组的肠上皮细胞,并检测其炎症信号通路的激活状态;（4）应用H＆E染色,观察并记录实验组和对照组中肿瘤组织的结构差异。为了研究DPI是否在CAC阶段直接抑制肿瘤的进展,我们又做了如下实验:（1）AOM+DSS建立小鼠CAC模型,在建立CAC模型的晚期,即第三个DSS和水的循环,腹腔注射DPI,和对照组溶剂;（2）在牺牲小鼠后,观察并统计小鼠肠道内肿瘤的数量、大小和小鼠肿瘤负荷的变化。为了探究DPI对肿瘤细胞的增殖和凋亡是否有直接的影响,我们做了如下实验:（1）在C57BL/6小鼠皮下注射MC38细胞悬液,建立移植瘤模型;（2）每日监测移植瘤大小,并腹腔注射DPI或对照组溶剂,然后牺牲小鼠观察实验组和对照组中移植瘤的大小;（3）应用免疫组织化学染色,在移植瘤组织中做免疫组化检测Ki67增殖指标,观察实验组和对照组之间的差异;（4）培养NCM460和MC38细胞株,并加入一定浓度的DPI和对照溶剂,经过相应的时间后,用CCK8试剂盒和凋亡试剂盒（Annexin V-FITC和PI）检测细胞的增殖和凋亡的变化;为了进一步了解,长时间腹腔注射极低剂量DPI是否会对小鼠的重要器官造成影响,我们做了以下实验:在未造模小鼠中腹腔注射21天极低剂量DPI和对照组,取出小鼠重要的器官,包括胃,脾,肺,肝,和肾并做H＆E染色,观察期结构形态。研究结果:（1）极低剂量NADPH氧化酶抑制剂DPI可以提高小鼠致死性肠炎的生存率;（2）极低剂量DPI可以缓解DSS诱导的小鼠肠炎;（3）极低剂量DPI可以降低小鼠体内炎症因子和ROS水平;（4）极低剂量DPI抑制巨噬细胞招募,但并不影响B细胞和T细胞在肠道固有层中的含量;（5）极低剂量DPI可以抑制M1型巨噬细胞激活,但并不影响M2型巨噬细胞的激活;（6）极低剂量DPI可以抑制炎症信号通路的激活;（7）早期应用极低剂量DPI可以缓解CAC进展;（8）晚期应用极低剂量DPI对CAC缓解并无明显作用;（9）长期使用极低剂量DPI并无明显毒副作用。研究结论:本研究证实通过改变NADPH氧化酶抑制剂DPI的浓度,应用极低剂量的NADPH氧化酶抑制剂DPI,同样可以到达到抑制肠道炎症的作用,并且在CAC早期应用极低剂量的DPI可以明显缓解CAC进展。这是因为极低剂量DPI可以抑制巨噬细胞招募、M1型巨噬细胞的激活、降低体内ROS水平并且抑制炎症信号因子的激活状态,从而抑制CAC进展。同时我们也证实,长期使用极低剂量DPI对小鼠重要器官并无明显的毒副作用,为IBD和CAC治疗的临床前研究提供了新的思路。