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【研究目的】非典型溶血尿毒综合征（Atypical hemolytic uremic syndromes,a HUS）是一种血栓性微血管病（Thrombotic microangiopathy,TMA）,临床表现为微血管溶血性贫血、血栓和急性肾损伤,多发于儿童。首次出现临床症状后,约33%-40%的患者发展为终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）甚至死亡,复发率高达50%,预后极差。目前研究认为,a HUS的致病机制主要是补体旁路途径过度活化导致内皮细胞损伤,多数患者具有补体蛋白H（CFH）、补体蛋白I（CFI）和膜辅因子（MCP）等补体相关因子的基因突变,然而,对于内皮细胞受损如何引起a HUS发病的分子机制所知甚少,补体相关基因突变与a HUS发病的内在联系也没有明确的研究。因此,根据a HUS已有的研究基础,本课题的研究目的是,建立诱导多能干细胞衍生的内皮细胞模型,揭示a HUS的疾病表型,寻找内皮细胞受损与a HUS发病的内在关联,阐明a HUS发生发展的分子机制。【研究方法】在本研究中,我们入组了3名a HUS患病儿童和2名健康儿童。3名a HUS患病儿童作为实验组（a HUS组）,2名健康儿童作为对照组（CON组）。培养5名受试者的皮肤成纤维细胞,之后使用非整合型仙台病毒（Non-integraed Sendai virus）将皮肤成纤维细胞重编程为人诱导多能干细胞（Human induced pluripotent stem cells,hi PSCs）,成功获得病人特异性的i PS细胞株。我们利用体外小分子化合物诱导的方法将i PS细胞成功分化为内皮细胞（induced pluripotent stem cells derived endothelial cells,i PSC-ECs）。通过检测内皮细胞的迁移能力、成管能力、增殖能力、凋亡能力等方面,系统比较了a HUS组和CON组内皮细胞的功能学差异,揭示了a HUS内皮受损的疾病表型;之后利用病人特异性的血清和抗H因子自身抗体刺激a HUS组和CON组内皮细胞,检测并比较两组内皮细胞的功能学差异,揭示病人血清对内皮细胞功能的损伤表型;之后通过对a HUS组和CON组内皮细胞的转录谱进行测序分析,发现了a HUS组与CON组信号通路的差异,继而对所观察到的关键信号通路进行了Western blot检测,利用特异性的激活剂和过表达载体对关键信号通路进行验证,阐明a HUS发生发展的分子机制。【研究结果】我们成功获得受试者的皮肤样本,培养皮肤成纤维细胞,利用非整合型仙台病毒将皮肤成纤维细胞重编程为i PSCs。利用小分子化合物的诱导方法,将i PS细胞株分化为内皮细胞（i PSC-ECs）,通过CD144磁珠分选获得纯度99%以上的内皮细胞,并对获得的内皮细胞进行CD144和Dil-Ac-LDL染色。之后在Basal水平对a HUS组和CON组的内皮细胞进行功能学检测,细胞划痕实验表明,a HUS组内皮细胞的细胞迁移能力明显低于CON组;血管生成实验表明,a HUS组内皮细胞的成管能力明显低于CON组;细胞增殖实验表明,a HUS组内皮细胞的增殖能力明显低于CON组。使用a HUS病人组血浆置换液中提取的血清,分别刺激a HUS组和CON组的内皮细胞,再次比较两组细胞的功能学差异,CCK8和TUNEL检测发现血清刺激能够显著降低两组内皮细胞的细胞活力,增大细胞的凋亡比例;细胞划痕和成管实验表明,血清刺激导致内皮细胞的迁移能力和成管能力降低,但是血清刺激对内皮细胞增殖并没有明显的影响。使用a HUS病人组血浆置换液中提取的抗H因子自身抗体,分别刺激a HUS组和CON组内皮细胞,CCK8和TUNEL检测均显示两组内皮细胞的功能学无明显差异,但是当把抗H因子自身抗体与正常人血清混合后再刺激内皮细胞,发现CON组和a HUS组内皮细胞的凋亡比率均明显增加。血清刺激实验表明a HUS病人特异性血清能够导致细胞凋亡,加重a HUS组内皮细胞的损伤表型,而a HUS病人特异性的抗H因子抗体在体外细胞的疾病表型方面并没有明显作用。将CON组和a HUS组i PSC-ECs进行转录组测序和生物信息学分析,结果显示差异基因主要富集在血管发育、脉管系统发育、肾脏发育和免疫系统等层次,在血管发生层面上,PECAM1、BMP4、HOXA3和FGF1等基因的表达量在a HUS组中显著降低,而这些基因均与MAPK信号通路相关联。我们对MAPK通路的下游通路ERK、p38、JNK进行蛋白磷酸化水平检测,发现在CON组和a HUS组中Erk和JNK的磷酸化水平没有明显差异,而p38的磷酸化水平明显降低。利用p38特异性激动剂,茴香霉素（Anisomysin,ANS）,刺激a HUS组内皮细胞,Western blot结果显示ANS可以显著提高p38的磷酸化水平;对ANS刺激前后的内皮细胞进行细胞功能学检测,结果显示ANS可以显著提高a HUS组内皮细胞的细胞迁移、成管和细胞增殖能力。MKK6是p38上游的活化激酶,在a HUS组内皮细胞中过表达MKK6,结果显示a HUS组内皮细胞的细胞迁移、成管和增殖表型可以得到明显恢复改善,提示我们p38 MAPK信号通路与a HUS疾病表型密切相关,可能参与了疾病的发生发展。【结论】我们成功获得了a HUS病人特异性的i PS细胞株,并通过体外分化技术建立了病人特异性的i PSC-ECs模型,a HUS病人特异性的i PSC-ECs表现出细胞迁移能力下降、成管能力下降和细胞增殖降低等疾病表型,转录组测序以及后续功能学分析表明,p38-MAPK信号通路可能参与了a HUS疾病的发生发展。