目的:本课题展开研究微生物来源的胞外粘质高分子多糖普鲁兰多糖对体外诱导骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化能力及体内软骨组织缺损的修复治疗作用。方法:第一部分方法:普鲁兰多糖水凝胶的可光固化改性及表征:将5.0g普鲁兰多糖溶于50mL蒸馏水中,搅拌溶解,50℃水浴搅拌加热,当温度达到50℃后缓慢滴加甲基丙烯酸酐(MethacryLic anhydride)5mL,边加边搅拌,用5moL/L的NaOH溶液将溶液pH调成中性,50℃水浴搅拌加热反应8小时,透析、纯化、冻干所得改性产物。用傅里叶红外光谱分析是否改性接枝成功,并用核磁共振氢谱进一步验证;用扫描电镜拍照,观察可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶的形态、孔径;测量杨氏模量和溶胀率,分析水凝胶的力学强度和溶胀性能。第二部分方法:可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化研究:提取SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增培养,取第三代种植于一系列不同浓度的普鲁兰多糖水凝胶表面,培养七天后,CCK8检测不同浓度普鲁兰多糖水凝胶对骨髓间充质干细胞毒性的影响,选出毒性最小的浓度用于制备水凝胶与第三代细胞混合形成水凝胶/细胞复合物;培养7天、14天、21天后钙黄绿素/PI染色观察细胞生存和增殖情况;HE染色观察细胞成软骨分化形态,番红O染色和GAG/DNA检测观察成软骨分化指标(糖胺聚糖)的分泌量;COL2al的免疫荧光染色观察软骨标志性特征蛋白Ⅱ型胶原蛋白的分泌量;培养7天、14天、21天后RT-PCR检测软骨相关特征性基因COL2a1、SOX9、ACAN、COL1a1、COL10a1的表达量验证成软骨分化能力。第三部分方法:可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶复合干细胞对体内软骨缺损修复再生作用的验证:构建SD大鼠关节软骨缺损模型,将不同组别的细胞、可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶/细胞复合物(B组、BS组、BC组、BP组)植入缺损部位,在术后第4周和第8周取材收样,拍照、对关节进行大体评分,观察其修复情况;多聚甲醛固定后,脱钙、石蜡包埋、切片,进行HE染色、番红固绿染色以及免疫组化染色并进行组织学评分观察不同组之间的修复情况。结果:第一部分结果:傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱显示成功对普鲁兰多糖进行酸酐改性,使其具有可紫外光固化成胶的特性,杨氏模量检测结果显示4%的水凝胶的杨氏模量为0.025±0.006MPa,8%为0.069±0.003 MPa,12%为 0.103±0.003 MPa,16%为 0.175±0.013 MPa。水凝胶的浓度越大,其杨氏模量越大。溶胀率检测结果显示6%的水凝胶的溶胀率约为50.53%,8%的水凝胶的溶胀率为42.38%,10%的水凝胶的溶胀率为37.88%,14%的水凝胶的溶胀率为29.67%,浓度越大,水凝胶的溶胀率越低。杨氏模量,溶胀率等随着水凝胶浓度的增加,而呈现出一定的线性相关。扫描电镜拍照结果显示普鲁兰多糖具有良好的通孔特性,8%的普鲁兰多糖水凝胶的孔径范围大小为121.27±47.58μm,其网状孔隙与胶原、海藻酸钠等水凝胶的网状结构相似,形成的孔径大小比较均匀。可通过调节水凝胶的浓度来使其具有良好的孔径和适合的杨氏模量,在结构上与软骨外基质的结构相似。第二部分结果:钙黄绿素/PI染色结果显示,随着培养时间的增加,细胞的数量越来越多,各水凝胶组细胞增殖良好,存活率高;HE染色结果显示BTC组和BTP组中均可见较多的软骨陷窝,番红O染色、GAG/DNA检测、COL2a1的免疫荧光染色结果表明普鲁兰多糖组和胶原水凝胶组中软骨细胞特异性细胞外基质(糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白)的分泌量相似;同时RT-PCR 检测(COL2a1、SOX9、ACAN、COL1a1、COL1Oa1)结果表明在普鲁兰多糖水凝胶组中软骨特异性标志基因COL2a1、SOX9、ACAN表达量与胶原组相似,甚至更高。第三部分结果:体内实验取关节大体观察结果显示,BP组对软骨缺损修复的效果与BC组相似,新生软骨组织与邻近正常软骨组织相近,效果明显好于其B组和BS组。组织学染色结果也与大体观察结果相符,验证了可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶复合干细胞对体内软骨缺损修复再生作用。结论:酸酐改性的普鲁兰多糖可紫外光固化成胶,具有良好的通孔性,溶胀率和力学强度;可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶具有和胶原水凝胶一样良好的体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化能力;可光固化改性普鲁兰多糖水凝胶复合干细胞对体内软骨缺损有良好的再生修复作用。