克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)是一种用于生产1,3-丙二醇的优良菌株。菌株代谢甘油生成1,3-丙二醇的相关酶由dha操纵子编码,二羟基丙酮激酶(DHAK)是dha操纵子编码的其中一个关键酶。编码DHAK的基因由4段序列构成,其中dhak编码二羟基丙酮激酶(DHAKI), dhakl, dhak2和dhak3共同编码二羟基丙酮激酶Ⅱ (DHAKII)。本论文主要就K. pneumoniae dha操纵子中编码DHAK的基因功能进行了研究。首先建立了一种适用于K. pneumoniae的同源重组方法,利用该方法对相关基因进行了重组失活,通过重组菌株的表型特性,初步推断DHAKⅡ在dha操纵子的表达中起主要调控作用。根据已公布的K. pneumoniae MGH78578编码DHAK的基因序列设计引物扩增K.pneumoniae TUAC01编码DHAK的基因并测序。同源性分析确定编码DHAKⅠ和DHAKⅡ的基因序列。针对K. pneumoniae TUAC01的电击转化方法,主要考察了电击电压、细胞的生长状态、感受态细胞的浓度、培养基EDTA的浓度、DNA的浓度等参数对转化效率的影响,建立了一种适合K. pneumoniae TUACOl的电击转化方法。结果：K. pneumoniae TUAC01培养基中添加EDTA至终浓度0.7mmol/mL;当细胞生长至OD600为0.7时收集菌体,制作感受态细胞；制作的感受态细胞浓度OD600大于30时,使用2mm的电转杯在2KV的电压下转化,转化效率达到8.58×105CFU/μgDNA。另外,基于质粒pIJ790、pCP20和pDK6构建了表达Red重组酶的质粒(pDK6-red)和表达FLP重组酶的质粒(pDK6-flp),建立了一套适合于K. pneumoniae的Red重组酶辅助的同源重组系统。借助构建的基因敲除系统,对K. pneumoniae TUAC01编码DHAK基因不同区域进行缺失突变,得到突变株KP△dhak,kp△dhakl,kp△Adhak2,kp△Adhak3,kp△dhak12, kp△DHAK。突变株发酵产物检测和酶学分析,DHAK的两个编码基因中,依赖于ATP的DHAKⅠ的缺失对菌株发酵生产1,3-丙二醇影响不明显,而依赖于磷酸烯醇式丙酮酸的DHAKⅡ在菌株dha操纵子中起调控蛋白的作用,dhakl和dhak2基因是dha操纵子基因表达所必需的。