背景与目的:皮肤由创伤、烧伤、感染或手术等原因引起纤维增生,通常会造成多种类型的瘢痕,其中最棘手的病理类型是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。瘢痕可导致皮肤不适感和功能受累,例如瘙痒或行动不便,同时也会对心理健康产生不良影响。目前瘢痕的治疗方法和效果仍然有限,病理性瘢痕由于术后复发率较高,会对患者造成很大的经济负担。因此,有效降低创伤后瘢痕发生率的问题亟待解决。研究表明胚胎早期的皮肤创伤后会完美的再生,但这样的能力却在胚胎晚期丧失,形成了因胚胎发育引起的两种截然不同的结局。早期对于胚胎期创伤的研究多基于大型的哺乳动物模型,而小鼠孕期短、成本低且与人类高度同源,因此也被逐渐纳入研究范围。然而由于手术难度较高,目前的研究开展范围仍然有限。有研究表明,与小鼠妊娠早期E16（embryonic day of 16）年龄创伤后接近正常愈合不同,妊娠晚期E18（embryonic day of 18）和成年期的伤口愈合均伴有纤维化。导致这种转变的机制尚未完全解析。因此,我们旨在从胎儿发育的角度探讨瘢痕形成的原因,寻找在胚胎晚期中导致瘢痕形成的关键基因及其调控分子,通过临床前检测获取干预效果,为临床上治疗病理性瘢痕提供新的思路。研究方法:1、本研究第一部分以C57B1/6J小鼠为研究对象,分别在胚胎不同时期（E16与E18）稳定构建了小鼠胚胎期宫内全层皮肤创伤模型。拍摄E16与E18创伤后修复的大体照片,明确胚胎E16与E18在创伤后愈合的差别;获得创伤后组织,通过H＆E（hematoxylin-eosin）染色分析E16与E18两组创伤后修复区域的组织结构差异;天狼星红染色分析两组的胶原结构,采用分形维数（fractal dimension,FD）和空隙度（lacunarity,L）评估胶原结构的差异;对E18产生瘢痕组的皮肤切片进行转化生长因子-β3（transforming growth factor-β3,TGF-β3）的免疫组化染色评估瘢痕生成。2、本研究第二部分以第一部分发现的结果为基础,选择小鼠E18天创伤后24小时的皮肤组织和其自身正常对照进行转录组学测序（n=3）。对结果进行GO（Gene Ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）生物信息学分析,其中涉及差异基因的生物学过程、分子功能和细胞组分的聚类和相关功能性信号通路的富集。使用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）验证筛选到的差异基因在E18创伤后24h组与正常对照组间的表达情况。3、本研究第三部分首先使用q RT-PCR、Western Blot实验检验组织蛋白酶（cathepsin S,CTSS）m RNA和蛋白在胚胎不同时期创伤后的水平;采用免疫组化实验对创伤组织的处的CTSS蛋白量进行染色定位。利用人皮肤成纤维细胞探讨CTSS的作用机制:合成CTSS敲低质粒后转染细胞并使用q RT-PCR、Western Blot实验证实基因敲低效果,进一步通过Western Blot实验检测瘢痕形成相关蛋白的表达水平（I型胶原、III型胶原、纤连蛋白）。通过q RT-PCR、Western Blot、免疫组化实验检测了干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7,IRF7）在胚胎不同时期创伤组织的表达水平。使用生信分析工具预测IRF7与CTSS的可能结合位点,合成IRF7过表达质粒和空白对照,结合双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀实验确证IRF7与CTSS启动子区域的结合。通过过表达成纤维细胞中的IRF7,采用q RT-PCR、Western Blot实验检测CTSS水平的变化。通过对瘢痕形成相关基因（I型胶原、III型胶原、纤连蛋白）的m RNA水平和蛋白水平验证IRF7/CTSS调控轴在瘢痕形成中的作用机制并使用回复实验进一步明确调控作用。最后,采用q RT-PCR、Western Blot、免疫组化实验检测IRF7和CTSS在人类瘢痕疙瘩患者皮肤组织中的表达水平。利用成年期小鼠增生性瘢痕模型研究CTSS体内作用机制,使用CTSS抑制剂LY30003283对创伤后的皮肤给药治疗,观察疗效,并进一步使用H＆E染色和免疫组化实验检测瘢痕面积和肌成纤维细胞标志物α-SMA（alpha smooth muscle actin）的表达。结果:1、胚胎期E16天与E18天的创伤都在48小时内愈合,但E16天皮肤完全再生而E18天皮肤产生瘢痕。H＆E染色和天狼星红染色分析结果表明E16天与E18天组织结构出现明显差异,E18天愈合后的组织更接近瘢痕结构。免疫组化染色显示,TGF-β3在E18天创伤后的瘢痕区域相比对照组表达明显减少。2、通过对小鼠E18天创伤后24小时的皮肤组织和其自身正常对照的转录组学测序,发现了283个差异表达基因,其中包括258个上调基因和25个下调基因,差异基因的生物学过程（biological process）较多包括对刺激的反应、代谢过程、细胞间通信。分子功能（molecular function）方面则更多地体现在蛋白质结合和核酸结合上。通过GO和KEGG富集分析了最相关的前十个信号通路,发现了二者交集中最具有显著性差异的信号通路——TLR（toll-like receptor）信号通路。TLR信号通路的差异基因经过验证与测序结果一致。3、根据差异基因的显著性、差异倍数挑选了TLR通路中的CTSS,验证了其在E16和E18创伤后呈现表达差异,即不生成瘢痕的E16天组与对照比无明显变化,而产生瘢痕的E18天组在创伤组织中明显上调。体外实验证实了抑制CTSS表达能够明显减少人皮肤成纤维细胞中I型胶原、III型胶原、纤连蛋白的表达。同时在TLR通路中发现唯一的转录因子IRF7呈现与CTSS一致的表达差异。双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀实验证实了IRF7与CTSS启动子区域的结合;过表达IRF7对CTSS表达有上调作用。上调IRF7/CTSS调控轴能够促进成纤维细胞中I型胶原、III型胶原、纤连蛋白的表达;回复实验进一步证明,过表达IRF7对下游瘢痕相关蛋白的上调影响可以通过敲低CTSS的表达干扰。瘢痕疙瘩患者皮肤组织中IRF7与CTSS也明显上调;成年小鼠体内给予CTSS抑制剂能够明显减轻瘢痕的增生和抑制肌成纤维细胞的活化。结论:1.胚胎发育的E16与E18天创伤后皮肤均可在48h后完成修复,E16天创伤可无瘢痕愈合而胚胎晚期E18天创伤后出现瘢痕。E18天是胚胎期创伤由无瘢痕修复向产生瘢痕过渡的关键发育时间点。2.小鼠胚胎期晚期E18天创伤后24h,处于创伤后的炎性反应期至增殖重塑期的过渡阶段,其中TLR信号通路的激活发挥重要作用。3.IRF7/CTSS调控轴在胚胎晚期差异化的表达促进了创伤后瘢痕的形成,IRF7作为转录因子激活CTSS的转录。4.IRF7、CTSS在不同胚胎期创伤后具有表达差异,此差异表达能够从胚胎晚期一直延续至成年期,与成人期形成病理性的瘢痕疙瘩密切相关。5.成年期小鼠创伤后,通过靶向抑制CTSS的表达可以有效地抑制瘢痕的生成和肌成纤维细胞的活化。