研究背景宫颈癌(Cervical Cancer,CC)是女性最为常见的肿瘤之一,为第四常见的恶性肿瘤,在女性恶性肿瘤中发病率居第二位。据统计,全球每年新诊断病例约530,000例,约275,000名患者死于该病。而发展中国家宫颈癌的发病率占全球总数的百分之85%,也是这些地区癌症死亡的主要原因。据调查,在中国,宫颈癌发病率为7.5/10万,而其中近一半人因此死亡,死亡率高达3.4/10万,故宫颈癌已经成为严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤之一。目前对于宫颈癌的治疗方案,仍然是包括了放疗、化疗和手术这几类方法。其中手术治疗仅限于那些早期疾病的女性以及对于生育没有要求的女性。放疗和以铂类药物为主的化疗相结合的方式则是治疗宫颈癌最常用的方法,并可以有效治疗宫颈癌。然而,无论是放疗还是化疗,在治疗肿瘤的同时也可能损害体内的正常细胞。近年来人们对宫颈癌的发病原因进行了很多深入的研究,并发现了包括人乳头瘤病毒在内的多个危险因素及肿瘤相关信号通路。而针对这些病因以及信号通路的治疗,也已进行了大量研究并已部分应用于临床。mTOR信号通路作为一种经典的信号通路,在细胞增殖、代谢等多个方面具有重要意义,近年来也逐渐发现该信号通路同宫颈癌之间具有极为密切的关系。有研究结果显示,mTOR上游调节基因的突变或功能的丧失已经证明与多种临床肿瘤的发生密切相关。更为重要的是,PI3K和Akt的过度激活,或者PI3K信号传导的负向调节抑制剂磷酸酶及张力蛋白同系物(Phosphatase and Tensin Homologue,PTEN)的遗传丢失或突变,已经在多种类型的人类恶性肿瘤中被发现。由于癌症中mTOR途径的过度激活在癌症的发生和发展中发挥着极为重要的作用,因此靶向致癌mTOR途径成分可能是一种有效的癌症治疗策略。Ras 相关 GTP 结合蛋白 D(Ras-related GTP-binding Protein D,RRAGD)是Rag GTP结合蛋白家族的一种,是一个单体鸟嘌呤核苷酸氨基酸结合蛋白,鸟嘌呤核苷酸集合蛋白构建异源二聚物需要氨基酸诱导mTORC1重定位到溶酶体上,随后通过GTPaseRHE活化,是通过氨基酸TOR信号级联的关键步骤,其在介导氨基酸激活mTOR信号通路起核心作用。已有较多关于RRAGD介导氨基酸激活mTOR信号通路机制的研究报道。然而RRAGD如何被调节的机理还不完全清楚。已有研究证实,NF-kB可以调控小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia Transcription Factor,MITF)在宫颈癌细胞中的表达。另一研究中对已发表的用于黑色素瘤转移病人(癌症基因组图谱数据集)和黑素瘤细胞系(基因表达综合数据库)的微阵列数据调查发现MITF和RagD基因表达水平之间具有显著相关性。而且公开可用的MITF染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)数据集表明MITF在COL0829黑色素瘤细胞中占据RRAGD的近端启动子,与我们的前期结果相一致。因此MITF可能正向调节RRAGD。而MITF能否直接调节RRAGD且通过mTOR信号通路调控宫颈癌的发生发展还未知。因此,本次实验我们首先检测了 15株宫颈癌细胞系的RRAGD和MITF的mRNA的水平,并运用ChIP-seq和si-RNA转染实验分析了 RRAGD和MITF的相关性,提出MITF可能参与调控RRAGD的假设;然后构建携带RRAGD基因启动子的荧光素酶报告载体PGL4.21(Luc2P/Puro)-RRAGD promoter重组质粒和相对应的启动子位点突变的载体,实验分组十五组,运用萤光素酶报告阵列(Luciferase Reporter Array)验证其假设;之后我们通过慢病的感染和CRISPR Cas9基因敲除技术构建人宫颈癌细胞RRAGD低表达体系,同时建立人宫颈癌细胞MITF高表达体系,运用不同的处理方法后对相关基因RRAGD,MITF,S6K,4EBP1的蛋白水平和分子水平进行检测,内容主要分为以下三个部分:第一部分RRAGD和MITF在宫颈癌细胞中的表达及意义目的:本课题的研究目的是探讨RRAGD和MITF在宫颈癌细胞系mRNA的表达水平及相互之间的关系,为进一步研究RRAGD和MITF的相关性及其在宫颈癌进展中的生物学功能提供实验依据。材料和方法:1.建立人原代黑色素细胞系,以人原代黑色素细胞为对照组采用Real time PCR方法检测15株人宫颈癌细胞系的RRAGD和MITF的mRNA表达水平(期间所有标本组织均来自于哈佛大学医学院麻省总医院)。2.染色质免疫沉淀(ChIP-seq)法检测人原代黑色素细胞中RRAGD和MITF相关性。3.采用 Real time PCR 方法检测转染转染 siRNA-Control、siRNTA-MITF-1和 siRNA-MITF-3 后人宫颈癌细胞 HeLa、HeLa S3、HeLa229 和 Hcp2 中 MITF和RRAGD mRNA的表达水平。4.实验数据均采用 GraphPad Prism 7 软件(GraphPad Software 7,Inc.,La JollalCA,USA)进行数据的统计分析,所有数据用均数±标准差(Mean±SD)表示。采用双侧Student’s t-test或Mann-Whitney’s检验进行两组数据间的比较,以α = 0.05作为检验水准。结果:1.人原代黑色素细胞系的成功建立。2.RRAGD与MITF在人宫颈癌细胞系中mRNA水平的表达的情况。Real time PCR结果显示,较人正常原代黑色素细胞HR5、X1/5、HeLa、C-4II、HeLaS3、HeLa229、Hep2(HeLa derivative)、HeLa B、Bu25 TK-、HeLa Ohio 细胞系 RRAGD 的 mRNA水平表达较高,HtTA-1、HR5-CL11、C-4I、CaSki细胞系RRAGD的mRNA水平表达较低;较人正常原代黑色素细胞HeLa、HeLa S3、HeLa229细胞系MITF的mRNA水平表达较高,HeLa DH、HtTA-1、HR5、X1/5、HR5-CL11、C-4I、C-4 II、CaSki(small bowel metastasis)、Hep2(HeLa derivative)、HeLa B、Bu25 TK-、HeLa Ohio 细胞系MITF的mRNA水平表达较低。3.人原代黑色素细胞中RRAGD和MITF相关性的分析。(1)MITF ChIP-seq显示MITF占据了原发性人黑素细胞中的RRAGD启动子。(2)H3K27ac ChIP-seq分析显示,si-MITF转染的人原代黑色素系细胞RRAGD启动子区域的H3K27ac水平显着降低。(3)因此,MITF和H3K27ac ChIP-seq表明MITF与RRAGD近端启动子结合并正向调节其在黑素细胞中的转录。4.转染siRNA-MITF之后MITF和RRAGD在人宫颈癌细胞的表达情况。(1)与阴性对照组相比,转染siRNA-MITF-1和siRNA-MITF-3的实验组在HeLa、HeLa S3、HeLa229和Hep2细胞中MITF mRNA的表达显著降低(P<0.001)。(2)与阴性对照组相比,转染siRNA-MITF-3的实验组HeLa、HeLaS3、HeLa229和Hep2细胞中的RRAGD mRNA的表达显著降低(P<0.001),转染siRNA-MITF-1 的实验组在 HeLa、HeLa S3 和 HeLa229 细胞中的 RRAGD mRNA的表达显著降低(P<0.01)。(3)siRNA-MITF-3 较 siRNA-MITF-1 的转染效率高,且在 siRNA-MITF转染效率高于80%的时候,RRAGD的mRNA水平才会明显降低。结论:RRAGD和MITF在人宫颈癌细胞系HeLa、HeLa S3和HeLa229中高表达,而且MITF可能参与调控RRAGD。第二部分MITF对RRAGD启动子活性调控作用的研究目的:本课题的研究目的是探究MITF是否可以直接调控RRAGD,为下面RRAGD参与调节宫颈癌的发展提供依据。材料和方法:1.运用Gibson method,以人原代黑色素细胞基因组DNA为模版、PCR扩增RRAGD(-1869 bp—213 bp)序列片段,构建携带RRAGD基因启动子的荧光素酶报告载体PGL4.21(Luc2P/Puro)-RRAGDpromoter重组质粒,运用基因测序技术鉴定重组质粒(所有测序均在哈佛大学医学院麻省总医院计算和整合生物学核心中心完成)。2.构建 PGL4.21(Luc2P/Puro)-RRAGD-mut(E-box)载体,运用基因测序技术鉴定重组质粒(所有测序均在哈佛大学医学院麻省总医院计算和整合生物学核心中心完成)。3.运用 Gibson method,构建 pcDNA3.1(+)-HA-hMITF-M 载体。4.运用萤光素酶报告阵列(Luciferase reporter array)实验检测启动子的活性:实验分组如下:转染对照组:Renilla-PGL4-pLKO.](shRNA 阴性转染对照组)Renilla-PGL4-shMITF-2(shRNA 转染对照组)Renilla-PGL4-shMITF-5(shRNA 转染对照组)Renilla-PGL4-pCW45(过表达阴性转染对照组)Renilla-PGL4-pcDNA3.1(+)-HA-hMITF-M(过表达转染对照组)转染实验组:Renilla-PGL4-RRAGD promoter-pLKO.1(shRNA 阴性转染实验组)Renilla-PGL4-RRAGDpromoter-shMITF-2(shRNA 转染实验组)Renilla-PGL4-RRAGDpromoter-shMITF-5(shRNA 转染实验组)Renilla-PGL4-RRAGDpromoter-pCW45(过表达阴性转染实验组)Renilla-PGL4-RRAGDpromoter-pcDNA3.1(+)-HA-hMITF-M(过表达转染实验组)突变实验组:Renilla-PGL4-RRAGDmut-pLKO.1(阴性转染突变实验组)Renilla-PGL4-RRAGDmut-shMITF-2(shRNA 转染突变实验组)Renilla-PGL4-RRAGDmut-shMITF-5(shRNA 转染突变实验组)Renilla-PGL4-RRAGDmut-pCW45(过表达阴性转染突变实验组)Renilla-PGL4-RRAGDmut-pcDNA3.1(+)-HA-hMITF-M(过表达转染突变实验组)实验方法:用脂质体法按以上分组分别同时转染至人宫颈癌细胞HeLa和HeLa229;转染72h之后用双荧光素酶监测系统检测细胞裂解液中萤火虫荧光素酶(firefly)和海肾荧光素酶(Renilla)的活性,计算其比值,两者的比值间接反映了启动子的活性。5.实验数据分析方法同第一部分。结果:1.成功构建构建 PGL4.21(Luc2P/Puro)-RRAGD Promoter,PGL4.21(Luc2P/Puro)-RRAGD-mut(E-box),pcDNA3.1(+)-HA-hMITF-M 载体。2.萤光素酶报告阵列(Luciferase reporter array)实验显示:(1)转染实验组的整体活性明显高于转染对照组,差别有显著统计学意义(P<0.01)。(2)突变实验组的整体活性低于转染对照组,差别有显著统计学意义(p<0.05)。(3)较shRNA转染阴性对照组shRNA转染对照组活性降低,差别有显著统计学意义(P<0.05);较shRNA阴性转染实验组shRNA转染实验组活性降低,差别有显著统计学意义(P<0.05);较过表达阴性转染对照组过表达转染对照组活性升高,差别有显著统计学意义(P<0.01);较过表达阴性转染实验组过表达转染实验组活性升高,差别有显著统计学意义(P<0.01)。(4)突变实验组五组转染整体活性水平差别不大,彼此之间差别无明显统计学差异。结论:MITF与RRAGD转录活性正相关且在转录水平调控RRAGD。第三部分RRAGD在宫颈癌进展中的功能性研究目的:本课题的研究目的是验证RRAGD在宫颈癌的作用,同时验证RRAGD通过mTOR信号通路调控宫颈癌的发展。材料和方法:1.用慢病毒感染的方法,转染shluc(阴性对照)、shRRAGD-1、shRRAGD-2至人宫颈癌HeLa细胞,建立稳定表达的HeLa-shluc、HeLa-shRIRAGD-1、shRRAGD-2 和 HeLa-shRRAGD 细胞体系,并用 Real time PCR方法进行检测。2.用CRISPRCas9方法敲除人宫颈癌细胞HeLa中的RRAGD基因建立HeLa-CRISPR-control、HeLa-CRISPR-RRAGD-1 和 HeLa-CRISPR-RRAGD-2 RRAGD低表达细胞体系并用Western blot法进行评估。3.用Western blot法检测无氨基酸培养基刺激慢病毒感染构建的RRAGD低表达HeLa细胞的RRAGD、MITF、S6K和4EBP1蛋白水平的表达情况。4.用RT-PCR 法评估分别用 pLJM.1-EGFP 和 pcDNA3.1(+)-HA-hMITF-M转染的HeLa细胞的RRAGD、MITF、S6K和4EBP1 mRNA表达水平的表达情况。5.实验数据分析方法同第一部分。结果:1.在HeLa细胞成功构建RRAGD低表达体系将shluc、shRRAGD-1和shRRAGD-2转染至HeLa细胞,待其稳定表达后,通过RT-PCR进行检测;结果显示相对阴性对照组HeLa-shluc,实验组RRAGD 的 mRNA 水平明显降低(P<0.05);较 HeLa-CRISPR-control 组 HeLa-CRISPR-RRAGD-1 和 HeLa-CRISPR-RRAGD-2 组 RRAGD 蛋白水平明显降低(P<0.05)。2.较 HeLa-shluc 细胞体系 HeLa-shRRAGD-1 和 HeLa-shRRAGD-2 细胞体系的RRAGD、S6K和4EBP1蛋白水平均明显降低,差别有显著统计学意义(P<0.05)。3.较 HeLa-CRISPR-control 细胞体系 HHeLa-CRISPR-RRAGD-1 和HeLa-CRISPR-RRAGD-2细胞体系的RRAGD、S6K和4EBP1蛋白水平均明显降低,差别有显著统计学意义(P<0.05)。4.无氨基酸培养基刺激慢病毒感染法构建的RRAGD低表达HeLa细胞体系相关因子蛋白水平的表达情况慢病毒感染构建的RRAGD低表达HeLa细胞在用无氨基酸培养基刺激72h后RRAGD、S6K和4EBP1的蛋白水平均显著升高,差别有显著统计学意义(P<0.05)。5.MITF高表达HeLa细胞体系的相关因子的表达情况较 HeLa-pLJM.1-EGFP 阴性对照组 RRAGD、MITF、S6K 和 4EBP1 的mRNA水平都显著升高,差别有显著统计学意义(P<0.05)。结论:氨基酸缺乏可以导致RRAGD的转录水平上调并导致mTOR1信号通路的激活;MITF的过表达可以导致RRAGD的转录水平上调和mTOR1信号通路的激活;RRAGD是宫颈癌过度生长的一个关键因素。