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马泰勒虫病是一种寄生于马属动物(包括马、驴、骡、和斑马)红细胞或淋巴细胞内的蜱传原虫引起的寄生虫病,世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)将其列为需要通报疫病,我国将其列为二类动物疫病。该病主要表现为精神不振,贫血,血红蛋白尿,黄疸等临床症状,严重者可造成马匹死亡。根据感染情况可分为急性,亚急性和慢性,慢性感染时其症状不明显,且长期处于“带虫”状态难以确诊。该病主要分布于美洲、非洲、亚洲、和欧洲南部等地。患病马的死亡可能与感染虫株的种类及强度、马匹健康状况和地方防治规程等因素有关。马梨形虫病防控的关键在于监控传染源(带虫马),虽有国外商品试剂盒,但其价格昂贵、检测样品受限制及对地方虫株特异性较差,需要有效的诊断方法以检测慢性感染的马匹。马泰勒虫裂殖子表面抗原1(EMA-1)是用于马梨形虫病诊断的重要靶抗原之一。因此,研究其抗原靶基因、建立实用的rEMA1-ELISA非常必要。(1)本研究根据马泰勒虫EMA-1基因序列设计合成引物,将编码的新疆株EMA-1全基因序列克隆于原核表达载体pGEX-4T-1和PET28a上,构建pGEX-4T-1/EMA1和PET-28a/EMA1重组质粒,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到EMA1融合蛋白,经切胶纯化后作为包被抗原,经反应条件优化后,建立检测马泰勒虫抗体的rELISA方法。结果显示,表达的GST-EMA1(56 kDa)和His-EMA1(36kDa)与其理论值基本一致;通过Western blot和IFAT分析证明EMA1蛋白具有很好的特异性、抗原性和免疫原性。(2)以(1)中纯化的GST-EMA1蛋白作为包被抗原,建立了rEMA1-ELISA诊断方法,可明显区分马泰勒虫、驽巴贝斯虫、马伊氏锥虫阳性血清和健康马血清;批内和批间重复试验的最大变异系数分别为14.79%和11.06%;最佳抗原包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为4℃过夜;最佳封闭液为0.05%脱脂乳;血清和酶标二抗的稀释度分别为1:400和1:20000,封闭时间、血清作用及酶标二抗孵育时间均为0.5 h;底物作用时间为15 min;其临界值为0.353;使用建立的rEMA1-ELISA与cELISA商品试剂盒分别对新疆伊犁马场收集的96份马血清样品进行检测,检出阳性率分别为27.1%(26/96)和25.0%(24/96),两者总符合率为95.8%;综上所述,基于原核表达的EMA1蛋白所建立的rEMA1-ELISA有很好的特异性、敏感性和重复性,可为新疆马泰勒虫病(特别是隐性带虫马)的检测、监控提供有效手段。