【摘 要】
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目的:本研究拟利用高分辨率熔解曲线（high-resolution melting,HRM）分析技术,通过分析致幻毒物的常用DNA条形码,并结合筛选的常见致幻蘑菇古巴光盖伞（Psilocybe cubensis）的核基因片段,建立一个快速、准确的致幻毒物种属鉴定方法,并验证该方法对致幻毒物及其相关物种的鉴别效果,为致幻毒物及其相关物种的种属鉴定、来源地推测和涉毒案件分析提供理论依据和应用基础,为社
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目的:本研究拟利用高分辨率熔解曲线（high-resolution melting,HRM）分析技术,通过分析致幻毒物的常用DNA条形码,并结合筛选的常见致幻蘑菇古巴光盖伞（Psilocybe cubensis）的核基因片段,建立一个快速、准确的致幻毒物种属鉴定方法,并验证该方法对致幻毒物及其相关物种的鉴别效果,为致幻毒物及其相关物种的种属鉴定、来源地推测和涉毒案件分析提供理论依据和应用基础,为社会稳定和公共安全提供有力支撑。方法:（1）收集古巴光盖伞、鹅膏菌、斑褶伞、大麻和罂粟等致幻毒物及其相关物种64种,利用DNA条形码测序方法确认所有样本的物种身份信息。（2）通过ROTOR GENE Q实时荧光PCR仪,结合HRM分析软件Rotor Gene Q Series Software分析所有物种的内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列及其亚区片段ITS1和ITS2序列,进行各物种的种属鉴定。（3）为提高该方法的鉴别能力和分辨率,筛选古巴光盖伞的核基因片段并设计引物:根据NCBI数据库下载的4个古巴光盖伞核基因（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,标记为 PC-3;psilocybin-related phosphotransferase gene,标记为 PC-PT;largest subunit of RNA polymerase Ⅱ,标记为 PC-R1;translation elongation factor 1α,标记为 PC-EF）的序列信息,使用Primer Premier 5.0软件设计基因片段PCR引物。（4）采用HRM方法计算7个目标遗传标记的-df/dT和Tm值并导出HRM图谱,对包括古巴光盖伞在内的64类物种进行分析,基于HRM图像和Tm值构建物种鉴定方法,并分析该鉴定方法对致幻毒物的鉴定效果。（5）验证该物种鉴定方法的准确性、重复性、灵敏度和同一性,分析64类物种的种属关系,并评估方法的混合物分析效能和多标记扩增效能。结果:（1）基于HRM技术,本研究建立了一种联合利用7个遗传标记鉴定致幻毒物的方法,该检测方法可以在3小时内,获取古巴光盖伞的多标记特异性HRM曲线及其 Tm 值（ITS:83.72±0.04℃、ITS1:80.98±0.04℃、ITS2:83.47±0.03℃、PC-R1:87.93±0.12℃、PC-PT:82.21±0.14℃、PC-3:79.72±0.12℃ 和 PC-EF:80.11±0.19℃）,从而快速鉴定常见致幻蘑菇古巴光盖伞。（2）除古巴光盖伞外,该方法还可有效区分含有神经致幻毒性或胃肠炎毒性成分的粪土生光盖伞、球基鹅膏菌、赭黄裸伞、大孢花褶伞和大麻等物种,为其余相关物种的快速鉴定提供参考数据。（3）该方法可以准确检测的最低DNA模板量为62.5 pg,在含有古巴光盖伞的微量样本和混合样本中均可有效鉴定出古巴光盖伞,并且可以联合多标记构建复合扩增体系。（4）本研究利用Sanger测序所获得57种菌菇样本的ITS序列信息,构建了 Neighbour-Joining（N-J）系统树以确认种属关系,结果显示,57种菌菇来自19科、35属。通过N-J系统树的种属分类结果,验证了 HRM种属鉴别方法结果的可靠性。结论:本研究联合ITS、ITS1和ITS2序列及其他4个筛选的DNA遗传标记,建立了一个基于HRM分析法进行致幻毒物种属鉴别的方法。根据HRM分析结果,该方法可以准确鉴别古巴光盖伞和其他相关致幻毒物,具有准确性高、灵敏度高、重复性好及抗干扰性强等优点。该研究为种属鉴定、医疗急救、毒品原植物分析和物种数据库的构建等司法鉴定和相关研究提供了有效的手段。
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