中药资源研究的一个重要目标就是培育品质优良的中药材。对于植物药来说,药效成分主要来自于植物自身所产生的次生代谢产物。因此,在中药材研究及实际生产中常实施多种策略来增加体内次生代谢产物的积累以提高药材品质。在关注植物中次生代谢产物为人类所用的同时,却很少关注这些化学成分的产生对植物本身的意义。人参为五加科人参属植物人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根和根状茎,在我国有上千年的用药历史,是我国临床应用最广泛的的中药材之一。由于人参有着独特的生长发育机制,能达几十年甚至上百年的生长周期,且其次生代谢产物人参皂苷有着广泛的药理活性,为比较理想的研究材料。因此,本论文以名贵中药材人参为研究对象,初步探索人参中人参皂苷的生理功能。人参始载于《神农本草经》,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。人参中的主要有效成分人参皂苷是一类具有达玛烷型或齐墩果烷型结构的三萜类合物。药理学研究表明,人参皂苷具有保护神经系统、心血管系统,调节内分泌系统,抗肿瘤,增强人体免疫力等生物学活性,为人参治疗心脑血管疾病和抗肿瘤的药效物质基础。人参皂苷的含量会随着人参生长年限的增加而增多。因此,一般认为,人参越“老”,人参皂苷含量越多,其品质也越好。近些年来的研究发现,人参皂苷对人体多种干细胞的增殖、分化、损伤修复及延缓端粒缩短等方面都具有调控作用,这为人参调控人体机能,延缓衰老的功效提供了科学依据。一般认为次生代谢产物在植物适应环境,克服外界环境压力和化学防御中发挥着重要作用,但越来越多的研究显示,这些化学成分对植物的生长发育也会产生重要影响,是植物生长发育调控中不可缺少的一部分。植物在生长发育过程中,会受到多种因素的影响,如外部的各种环境因子、生物因素,内部的遗传特性、相关的调控因子、活性氧、内源激素、干细胞、端粒等,其中位于植物根尖和茎尖的干细胞,能不断进行自我更新并持续分裂,修复和更新损伤的细胞,而且能根据内部和外界环境信号来决定植物器官的发生、生殖生长、衰老等,从而使生长上百年甚至上千年的植物一直保持新生活力。端粒作为染色体末端的简单重复序列,在DNA复制时丢失自己的碱基以保护DNA复制的完整和稳定。当端粒长度缩短到一定程度,细胞就停止分裂,逐渐衰老死亡。因此,端粒对维持染色体的稳定和细胞分裂能力具有重要作用,也成为DNA的“年轮”和分子钟,在一定程度上反映生物个体的年龄水平。人参皂苷为人参所产生的次生代谢产物,对人和动物的干细胞和端粒长度的调控有着重要的影响,且动物和植物有相似的干细胞调控行为,而植物干细胞和端粒在植物生长发育、衰老等生物学过程中也发挥着重要作用。因此,基于以上研究基础,本论文将通过研究人参皂苷对植物干细胞和端粒的影响,来揭示人参生长发育中人参皂苷的生理生化功能。通过研究,为初步揭示人参的生长机制提供参考,同时也为药用植物次生代谢产物的生理功能研究提供新的研究思路和方法。基于以上研究认识,本论文开展了如下工作：1人参皂苷含量随年限的变化规律研究采用UPLC-MS的方法对1-13年人参中的8种主要人参皂苷成分（人参皂苷-Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rf、Ro）进行定量分析,发现人参总皂昔在人参不同药用部位中的含量差异较为明显。人参叶中的人参皂苷成分含量最高,其总皂苷含量随生长年限变化波动较大,在13年内总皂苷含量由36.64 mg/g升高到59.03 mg/g,人参皂苷积累增加较为明显；芦头中皂苷含量较叶低,其中2-7年生人参的芦头中总皂苷在23.09-31.88mg/g范围内波动,含量相对稳定,而在第8年生时芦头中皂苷积累量迅速增加至43.92 mg/g,随后3年含量基本保持不变（39.56～40.83 mg/g）,当生长至第12、13年时,芦头中皂苷含量又迅速升局（58.73 mg/g、65.30 mg/g）;人参主根中皂苷含量最低,随年限增加呈现平稳升高的趋势,在13年内人参皂苷积累量增加约1倍（16.27 mg/g-31.14 mg/g）。研究还发现,人参皂苷单体成分在不同部位中的分布也不同,其中人参皂昔Rg1和Re在人参叶中的含量远远高于其他成分,但在主根和芦头中含量却低于人参皂苷Rb1；齐墩果烷型人参皂苷Ro在3个药用部位中含量差异不明显,且均随年限延长而积累量逐渐增加；人参皂苷在根皮中积累量最多,形成层和韧皮部的人参皂苷含量次之,木质部中皂苷的含量是最少,且根皮中人参皂苷含量是其他组织中的2倍以上。2影响拟南芥根尖干细胞分裂的人参皂苷成分的筛选研究在细胞分裂活跃的根尖分生组织的顶端,由一群快速分裂的不同类型的干细胞围绕着一团分裂活性极低的细胞（静止中心）共同组成根尖干细胞微环境的组织结构。由于人参的全基因组序列还未完全被解析,干细胞的组织形态学研究处于空白状态,模式植物拟南芥有着相对清晰的干细胞调控研究体系。因此,选择在拟南芥体系中筛选出对植物干细胞有影响的人参皂苷成分。结合人参皂苷不同的化学结构类型和含量变化规律,以原人参二醇类成分中含量最多的人参皂苷Rb1及其皂苷元20（S）原人参二醇,原人参三醇类成分中含量最多的人参皂苷Rg1、Re及其皂苷元20（S）原人参三醇和齐墩果烷型人参皂苷Ro等6个代表性成分进行筛选。在含有50、100、150μM人参皂苷成分的1/2 MS培养基中分别播种野生型拟南芥种子（Col-0型）,发现这些成分的加入对拟南芥种子的萌发没有影响,但对其幼苗初生根长有不同程度的抑制作用,且具有浓度依赖性,其中以人参皂苷中的某一成分GS1抑制根长作用最为显著：在组织水平观察根尖分生区,发现分生区范围的缩小与抑制根长的趋势具有一致性；在分子水平上GUS染色观察分生区细胞分裂活性,发现表征细胞有丝分裂活性的标记基因CycB1;1:GUS的染色区域与抑制根长程度也较为一致,其中仍以GS1的作用最为明显,染色区域最少。随后选择100μM GS1处理荧光标记静止中心（WOX5:GFP; QC184:GUS）及根冠干细胞（J2341:GFP）区域的拟南芥材料。激光共聚焦显微镜下观察发现,与空白对照相比,GS1的加入能促使根尖静止中心WOX5基因表达的荧光区域扩展,静止中心报告基因QC184的GUS染色区域也部分扩增,预示着静止中心细胞发生了分裂；同时标记根冠干细胞的报告基因J2341的荧光区域也发生了扩展,表征根冠干细胞发生了分裂。通过对PLT1/2及SCR/SHR两个主要的干细胞调控通路中的关键基因进行检测,发现GS1的加入并不能影响相关基因的表达,对建立和维持干细胞微环境的生长素的浓度梯度也未发生较大的改变。研究结果表明,人参皂苷类成分对拟南芥初生根长有不同程度的抑制作用,这种作用是通过抑制根尖分生区细胞分裂活性导致分生区范围缩小而实现的；GS1能强烈抑制拟南芥初生根长,但同时却能促使其局部区域一根尖干细胞中心发生活动,静止中心和根冠干细胞均发生了细胞分裂。因此,GS1不但能对拟南芥初生根长的生长产生影响,同时也能影响根尖干细胞微环境的稳定状态,促使根尖干细胞和静止中心同时发生分裂,调控根尖干细胞的活性,但其作用机制还不清楚。因此,为阐明GS1对拟南芥根长的作用机制,需通过正向遗传学方法运用遗传筛选和图位克隆的手段找到其作用基因。3 GS1对拟南芥根长影响的遗传筛选及图位克隆研究在含有100μM GS1的1/2 MS培养基上播种EMS诱变的约980个编号的拟南芥突变体群,从中筛选出对GSl不敏感的突变体即根长较长的种子,并移于土中收种再进行验证。在初次筛出的12个突变体材料中最终经过第二代种子验证确定编号为14的突变体（Ginsenoside insensitive mutant:gsi）的初生根长不受GS1的影响,为所需要的阳性材料。不断播种gsi进行筛选至纯合的种子,将纯合的植株与另一生态型（Ler型）植株进行杂交,以突变体F2代杂交种为样本进行图位克隆,提取约100个突变体样品的DNA,以拟南芥5条染色体上22个SSLP标记分子进行筛选粗定位,初步确定突变点范围。在突变位置附近左右分别用1对引物进行筛选,并不断向内侧设计引物缩小突变位点的范围以精细定位,在经过约2400个样品的筛选后,确定突变基因在约60 kb的范围内,在此范围内共包含有10个基因。为确定突变位点,将10个基因全部克隆出来,连接载体测序。测序结果显示,序列号为AT5G20950的基因在其CDS区发生了一个碱基的突变,核昔酸序列由G突变成了A,同时导致了其氨基酸的变化,由甘氨酸（G）变成了精氨酸（R）,而其他基因核苷酸序列并未发生改变。通过与SALK突变体库该基因的突变体（SALK₀58396C）表型相比较,发现SALK₀58396C的初生根长也不受GS1的影响,且根长与所筛到的突变体较为一致。将该基因完整的CDS序列通过农杆菌介导转化到突变体gsi中进行遗传互补,经T2代纯合体验证,其表型也得到了恢复。因此,可确定该基因的突变确能导致对GS1的不敏感,同时也证明该基因在GS1抑制拟南芥的根长中发挥重要作用。4 GSl作用基因的功能验证研究进一步对突变基因（AT5G20950）进行生物信息学分析,发现该基因所编码的是一种糖苷水解酶（Glycosyl hydrolase）,因此,将该基因命名为GH。糖苷水解酶蛋白是由625个氨基酸构成,有Glyco_hydro₃和Glyco_hydro₃C 2个功能保守区,其中Glyco_hydro₃C在参与催化反应及结合葡萄糖中发挥重要作用。而所筛选出的突变位点正是在这一重要保守区内,此突变位点的存在可能也是导致其功能缺失的直接原因。为确定该糖苷水解酶是否对GS1有水解作用,将GH基因连入PMAL载体进行蛋白原核表达。以所得到的蛋白为酶液,NaAC缓冲液（pH 5.0）为酶促反应液,以GS1为底物进行酶促反应。将酶促反应产物进样UPLC-Q/TOF-MS分析,发现加入表达蛋白的反应产物中有一个新的产物生成,且这一产物的分子离子质量数（m/z）与GS1相比,丢失了一个葡萄糖的分子量。将所生成的新产物与另一皂苷成分GS1-1质谱信息相比,二者的保留时间及离子峰均相同；同时将gsi播种于含有100μM GS1-1的培养基中,发现gsi表现为与Col-0相似的短根表型,GS1-1严重抑制gsi的初生根长,可确定GS1水解后的产物为GSl-1。充分的实验结果显示,在拟南芥体系中,当加入GS1处理后,植物体内的糖苷水解酶能水解该成分中的一个葡萄糖,转化为另外一种人参皂苷GS1-1,从而发挥抑制初生根长的作用。5人参皂苷对人参端粒长度的调控作用研究为进一步研究人参皂苷对人参端粒长度的调控作用,采用qPCR （real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction）的方法检测了1-6年生人参相对端粒长度在不同生长时期的变化情况。在主根中,端粒长度在第1年是较长的,但随后会出现逐渐缩短的趋势,在第3、4年端粒长度达到最低值,而后又出现逐渐延长趋势；人参叶中的端粒长度随年限变化趋势与主根较为一致。在不同的生长时期,端粒长度变化较大。端粒这种随年限的变化很有可能与植物自身的生长发育调控有关。中年限（10-14年）和长年限（15-30年）人参的端粒长度检测显示,人参的相对端粒长度有随年限增加而呈缓慢延长的趋势。为进一步研究同样随年限增加的人参皂苷是否对端粒长度有影响,在人参悬浮细胞体系中分别加入不同浓度（5、50、200μM）的3种主要人参皂苷成分—人参皂苷Rg1、Re、Rb1,测定处理后端粒的变化。实验结果发现,在5、50μM浓度下,3种成分均显示对人参悬浮细胞端粒延长的作用,但在200μM浓度下却有着轻微缩短端粒长度的作用,同时检测端粒酶基因均表达上调。因此,本部分的研究结果显示,人参端粒长度在1,6年有不稳定的变化,但随着年限的增加,端粒长度呈逐渐延长的趋势。同时,随年限增加积累增多的人参皂苷成分对自身端粒有一定的延长作用,且这种作用是通过激活端粒酶活性来实现的。化学防御一直被认为是植物次生代谢产物的主要生理功能,而本研究揭示,次生代谢产物人参皂苷能通过调控植物干细胞和端粒长度对植物的生长过程产生影响。作为小草本植物,人参能有长达几十年的生长周期,其次生代谢产物人参皂苷随年限增长积累增加。端粒作为年龄的生物标记,在草本植物人参中发现,和“长寿”的木本植物相似,其长度会随生长年限的增加而延长,且人参皂苷有助于端粒的这种延长效应。另外,端粒长度被发现在植物根尖干细胞区域是最长的,本论文同时揭示人参皂昔也能对植物干细胞产生影响。因此,人参皂苷与植物干细胞、端粒有着密切的联系,通过相互的影响与调控共同维持着人参的持续生长,在人参的“长寿”中可能发挥着重要的作用。本文在研究思路上,以影响植物生命活力的干细胞和端粒为切入点,为植物次生代谢产物的生理功能研究提供了新的视角；研究方法上,采用分子遗传学的手段阐明了人参中次生代谢产物人参皂苷对生长发育的生理生化作用机制。同时,这些探索性研究为“长寿”植物的生长机制研究提供了参考。